慢性高原病患者骨髓组织中BcI-w和Bid蛋白的表达研究*

张朝霞，崔森，张萍，王花，刘芳

（1.青海卫生职业技术学院临床医学系，青海 西宁 810000；2.青海大学附属医院血液科，青海 西宁 810001）

·临床论著·

慢性高原病患者骨髓组织中BcI-w和Bid蛋白的表达研究*

张朝霞1，崔森2，张萍1，王花1，刘芳1

（1.青海卫生职业技术学院临床医学系，青海 西宁 810000；2.青海大学附属医院血液科，青海 西宁 810001）

目的研究Bcl-w和Bid蛋白在慢性高原病（CMS）患者骨髓组织中的表达情况，探讨它们在CMS发生、发展过程中的作用。方法选取18例CMS患者为CMS组，应用免疫组织化学SABC法检测骨髓组织中Bcl-w和Bid蛋白的表达情况。16例单纯陈旧性骨折患者为对照组。结果CMS组骨髓组织中Bcl-w及Bid蛋白阳性表达率分别为77.78%及11.11%，对照组骨髓组织中Bcl-w及Bid蛋白阳性表达率分别为31.25%及50.00%，CMS组骨髓组织中Bcl-w蛋白阳性表达率明显高于对照组（P＜0.05）；而CMS组骨髓组织中Bid蛋白阳性表达率明显低于对照组（P＜0.05）。CMS组Bcl-w、Bid阳性系数分别为（4.15±2.11）及（0.33±0.18），对照组Bcl-w、Bid阳性系数分别为（0.87±0.43）及（0.93±0.51），差异有统计学意义（P＜0.05）。CMS组Bcl-w蛋白表达阳性系数与血红蛋白浓度呈正相关（r=0.835，P＜0.05），而Bid蛋白阳性系数与血红蛋白浓度呈负相关（r=-0.659，P＜0.05）。结论CMS患者骨髓组织抗凋亡蛋白Bcl-w表达增高，促凋亡蛋白Bid表达降低，Bcl-w和Bid蛋白表达变化与CMS骨髓红细胞凋亡异常有关。

慢性高原病；Bcl-w；Bid；细胞凋亡

慢性高原病（chronic mountain sickness，CMS）是生活于2 500米以上地区的世居和长期移居居民，对高原低氧环境逐渐失去习服而发生的临床综合征，又称Monge病，曾称高原红细胞增多症（high altitude polycythemia，HAPC），以过度红细胞积累和严重低氧血症为特征[1]。CMS的发病机理尚未完全阐明，既往研究肯定了红细胞增殖在CMS发病中的作用，但对细胞凋亡方面的研究非常有限，细胞凋亡与细胞增殖一样，在机体中发挥着重要的调控作用，可能在CMS的发生发展中发挥着重要作用。近期对其骨髓细胞凋亡的研究受到高度关注，发现CMS患者骨髓造血细胞凋亡减少[2-3]，而且CMS骨髓细胞凋亡减少的分子机制可能涉及到Fas/FasL、TNF/TNFR信号系统以外的其他凋亡分子和途径[4]。Bcl-2家族中家族中的Bcl-w和Bid蛋白是细胞凋亡的关键调节蛋白，与线粒体依赖的细胞凋亡有关。本研究通过免疫组织化学SP法检测CMS患者骨髓组织中Bcl-w和Bid蛋白表达水平变化，探讨他们在CMS发生、发展中的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料

18例男性CMS患者（CMS组），年龄（42.8±11.5）岁，均长期居住在海拔2 800～4 500米地区。CMS组患者血红蛋白（HGB）浓度（235.6±16.4）g/L，符合第六届国际高原医学和低氧生理学学术大会《慢性高原病青海诊断标准》确诊[1]。对照组选取同海拔地区16例单纯陈旧性骨折患者，年龄（43.5±11.1）岁，均为男性，研究对象均排除各种急、慢性感染及原发性心、肺、肝、肾疾患。本研究经过青海大学附属医院医学伦理委员会同意，并取得研究对象的知情同意。两组间年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2标本采集及处理

采集空腹静脉血2 ml注入含有EDTA的试管中充分混匀，行血细胞学分析。行骨髓活检术取骨髓组织，标本经10%中性甲醛溶液固定，脱钙液脱钙，石蜡包埋，4μm厚连续切片。

1.3实验方法

应用免疫组织化学SP法检测骨髓组织Bcl-w和Bid蛋白，试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，具体操作步骤按说明书进行。

1.4BcI-w和Bid染色结果判定

所有染色切片均由3人计数1 000个细胞中阳性细胞数，每份样本用双盲法阅片2次，取平均值。Bcl-w和Bid蛋白主要存在于细胞浆，阳性表达为棕黄色颗粒。为精确判断蛋白的表达程度及减少假阳性率，记分标准参照许良中等[5]的方法，根据细胞浆的着色程度及着色细胞的百分率进行评分，并计算阳性系数（评分标准见表1）。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘，即为阳性系数。阴性是指阳性系数为0、1分者，2、3分为（+），4～6分为（++），如为9分为（+++）。

1.5统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，显著性检验用t检验和Fisher确切概率法，两指标间相关性分析用直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 免疫组织化学染色记分标准

2 结果

2.1CMS组及对照组Bid和BcI-w的表达

CMS组和对照组骨髓组织中Bcl-w和Bid蛋白表达情况见表2～4。CMS组Bcl-w蛋白表达阳性率和阳性系数均高于对照组（P＜0.05）；CMS组Bid蛋白表达阳性率和阳性系数分别低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表3、4）。CMS组及对照组Bcl-w和Bid蛋白表达见图1。

2.2BcI-w和Bid蛋白表达与血红蛋白（Hb）之间的相关性

CMS组中，Bcl-w蛋白表达阳性系数与Hb浓度间呈显著正相关（r=0.835，P＜0.05），见图2；Bid蛋白表达阳性系数与Hb浓度间呈显著负相关（r=-0.659，

P＜0.05），见图3所示；Bcl-w与Bid蛋白阳性系数间未发现明显相关性（P＞0.05）。

表2 骨髓组织中BcI-w和Bid蛋白的表达情况例（%）

表3 骨髓组织中BcI-w和Bid蛋白阳性表达情况

表4 骨髓组织中Bid和BcI-w蛋白表达阳性系数

图1 BcI-w和Bid蛋白在骨髓组织中的表达（免疫组织化学SP法DAB染色标尺示50μm）

图3 CMS组Bid与Hb关系散点图

3 讨论

CMS发病机制复杂，人们从红细胞生物学特性、种族差异性、基因[6]、VEGF[7]、端粒酶等不同角度多方面研究高原适应及CMS的发病机制。CMS的根本原因是高原低氧，大量研究证明低氧可造成线粒体损伤，线粒体跨膜电位破坏，离子流动变化，而致呼吸链破坏，更重要的是释放凋亡相关的分子如Smac/ DIABLO、HtrA2/Omi和细胞色素C等而促进细胞凋亡[8-9]。从理论上说，低氧可诱导或促进细胞凋亡，但对于CMS来说，骨髓细胞凋亡的调节机制更为复杂。近几年对CMS发病机制的研究显示，CMS患者有核红细胞凋亡指数下调[2-4]，其机制与Bcl-2家族中的Bcl-2、Bcl-XL[10]、Bax、Bid[3]及Bak[11]表达异常有关。低氧诱导缺氧诱导因子高表达可广泛激活许多缺氧反应基因（HRGs），众多的HRGs传导细胞增殖信号，促进红细胞增殖的同时也传导抗凋亡信号而抑制细胞凋亡。Bcl-w主要分布于线粒体膜上，维持线粒体膜稳定性，阻止线粒体释放凋亡相关分子而发挥抗凋亡作用[12]，与细胞色素C线粒体途径的细胞凋亡密切相关。而造血干细胞因子可上调Bcl-w，通过对抗细胞凋亡而发挥对造血细胞的正调节作

用。线粒体途径可以通过利用caspases与促凋亡蛋白之间的相互作用实现细胞凋亡的调节[13]。激活的caspase-8能使胞质中的Bid断裂成tBid，tBid转移到线粒体上，诱导细胞色素C从线粒体释放进人胞质，从而把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效地扩大了凋亡信号。活化的Bid蛋白可通过与Bcl-2、Bcl-XL及Bc1-w等结合，减弱其抑制凋亡作用而促进细胞凋亡[14]；活化的Bid蛋白也可与Bax、Bak等结合，使Bax、Bak插人线粒体膜，从而诱导线粒体蛋白的释放，促进细胞凋亡[15-16]。

本研究结果显示，CMS患者骨髓组织中凋亡相关蛋白Bcl-w表达增高，Bid表达降低，提示线粒体途径参与了CMS凋亡下调机制。研究结果还显示CMS患者骨髓组织中Bcl-w表达升高且与血红蛋白浓度间呈正相关，Bid表达降低且与血红蛋白浓度间呈负相关，提示CMS患者骨髓红细胞凋亡下调的机制与Bcl-w及Bid表达异常有关，由此引起的骨髓造血细胞凋亡下调与红细胞增殖增强在CMS发病中起协同促进作用，提示线粒体途径细胞凋亡信号变化与CMS骨髓细胞凋亡异常可能有着一定的关系。今后将进一步研究CMS骨髓造血细胞凋亡、下调及Bcl-2家族蛋白表达变化的机制，为开展CMS干预性研究提供理论依据。

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（刘东京 编辑）

Expressions of Bcl-w and Bid proteins in bone marrow of patients with chronic mountain sickness*

ZHao－xia ZHANG1,Sen CUI2,Ping ZHANG1,Hua WANG1,Fang LIU1
(1.Department of Clinical Medicine,Health Professional Technological College of Qinghai, Xining,Qinghai 810000,P.R.China;2.Department of Hematological,the Affiliated Hospital,Qinghai University,Xining,Qinghai 810001,P.R.China)

【Objective】To study the expressions of Bcl－w and Bid in bone marrow tissue of patients with chronic mountain sickness(CMS),and explore their possible roles in the developing process of CMS.【Methods】The samples of bone marrow used in this study were obtained from 18 patients with CMS(CMS group)and 16 patients with old fracture(control group).The expressions of Bcl－w and Bid in the bone marrow tissues were detected using the SP immunohistochemistry technique.The results were analyzed and compared between both groups.【Results】The positive rates of Bcl－w and Bid proteins were 77.78%and 11.11% in the CMS group,and 31.25%and 50.00%in the control group,respectively.The expression of Bcl－w in the CMS patients was significantly higher than that in the controls(P＜0.05),but the expression of Bid in the control group was much higher than that in the CMS group(P＜0.05).The positive coefficient of Bcl－w protein in the CMS group was significantly higher than that in the control group[(4.15±2.11)vs(0.87±0.43),P＜0.05].The positive coefficient of Bid protein in the control group was significantly higher than that in the CMS group[(0.93±0.51)vs(0.33±0.18),P＜0.05].In the CMS group,hemoglobin(Hb)value was positively correlated with Bcl－w protein and negatively correlated with Bid protein(r=0.835,－0.659respectively,both

chronic mountain sickness;Bcl－w;Bid;apoptosis

R594

A

1005-8982（2015）24-0019-04

2015-04-20

青海省卫生厅2012年医药卫生科研指导性计划课题

P＜0.05).【Conclusion】The over－expression of Bcl－w and low－expression of Bid might be involved in mechanism of the change of erythroblast apoptosis in CMS patients.