CS-g-PEI的均相制备及在基因治疗中的应用*

陈会英，张久明，韩颖，孙丹丹，崔韶晖，赵轶男，张树彪

[大连民族学院生命科学学院（国家民委-教育部生物资源与技术利用国家重点实验室），辽宁 大连 116600]

·论著·

CS-g-PEI的均相制备及在基因治疗中的应用*

陈会英，张久明，韩颖，孙丹丹，崔韶晖，赵轶男，张树彪

[大连民族学院生命科学学院（国家民委-教育部生物资源与技术利用国家重点实验室），辽宁 大连 116600]

目的采用绿色溶剂离子液体合成不同接枝率的非病毒基因载体壳聚糖接枝聚乙烯亚胺（CS-g-PEI），获得高效低毒的壳聚糖基非病毒基因治疗载体。方法以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（[BMIM] Cl）为反应介质，羰基二咪唑（CDI）为键合试剂，均相合成壳聚糖（CS）接枝聚乙烯亚胺（PEI），得到不同接枝率的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺共聚物，采用红外光谱对接枝共聚物进行了结构表征。在人脑癌细胞（Hep-2）中采用绿色荧光蛋白（GFP-N2）和MTT法对其基因转染性能和细胞毒性进行体外评价。结果离子液体中均相合成的CS-g-PEI具有高的基因转染效率和低的细胞毒性。结论合成的CS-g-PEI是一种高效低毒的基因转运载体，具有临床应用的潜力。

基因治疗；离子液体；壳聚糖；聚乙烯亚胺；接枝共聚

肿瘤已成为目前威胁人类健康和生命的头号杀手，发病率随着各种因素的影响正呈快速上升趋势[1]。基因治疗技术是一项生物医学高新技术，其运用于肿瘤治疗将为癌症的临床治疗开拓一个新的空间[1-3]。基因治疗的关键在于开发安全、高效的基因递送载体。基因递送载体分为病毒和非病毒载体两

类[4]。病毒载体因在多数情况下具有较高的转染效率被广泛研究[5]。但目前研究和应用的病毒载体存在许多不足，如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等，限制了其在临床治疗中的应用。非病毒基因载体因免疫原性低、安全性高、容量大和易于批量生产等优点愈来愈被重视[6-7]。天然阳离子碱性多糖壳聚糖，是天然多糖甲壳素（chitin）完全或者部分脱乙酰化的产物，具有良好的生物相容性、可降解性、低免疫原性、良好的细胞黏附能力及跨膜特性等优点，正成为非病毒基因载体的热门研究内容之一[8-11]。然而由于壳聚糖自身水溶性较差，与其他阳离子聚合物或者阳离子脂质体相比，转运核酸进入细胞的效率并没有优势。为了改进和拓宽壳聚糖在基因转运中的应用，研究人员对壳聚糖进行了各种修饰改性[12]。但壳聚糖的高结晶性和难溶性使得许多对其改性修饰的化学反应只能在多相介质中进行。最近随着壳聚糖溶解体系的深入研究，均相衍生化和均相接枝化的研究方法不断出现[13]。

本研究在离子液体[BMIM]Cl为反应介质均相制备CS-g-PEI的研究工作的基础上[14-15]，在[BMIM] Cl中制备了不同接枝率的CS-g-PEI非病毒基因载体，并采用GFP-N2质粒DNA和MTT法对其基因治疗性能进行了体外评价。

1 资料与方法

1.1材料与试剂

壳聚糖（CS，Mw=40 000，脱乙酰度≥85%），国药试剂，使用前经100℃真空干燥8 h，聚乙烯亚胺（PEI，Mw=1 800），纯度99%），阿拉丁试剂有限公司，使用前在80℃真空干燥24 h，聚乙烯亚胺（PEI-25，Mw=25 000），纯度99%，Sigma试剂有限公司，1-丁基-3-甲基咪唑氯盐[BMIM]Cl，按照文献制备[16]，使用前在80℃真空干燥24 h，羰基二咪唑（CDI），分析纯，北京偶联试剂有限公司，质粒pGFP-N2和pGL3，Promega公司，细胞培养基DMEM，Invitrogen公司；荧光素酶检测试剂盒，Promega公司，人宫颈癌细胞株Hep-2，上海细胞库。其余材料和试剂均为分析纯。

1.2仪器设备

红外光谱仪（PRESTIGE21，日本），高温灭菌锅（Tomy，日本），二氧化碳培养箱（NAPCO6500，法国），多功能酶标仪（伯乐680，美国），微光发光检测仪（Synergy2，美国），凝胶成像系统（KODAK，美国），倒置荧光显微镜（蔡司AZIOVERT-25CFL，美国）。

1.3方法

1.3.1CS-g-PEI的均相合成在反应器中加入20 g[BMIM]Cl，置入80℃油浴中加热熔化。加入0.5 g壳聚糖，在氮气气氛下搅拌，通过偏光显微镜观察，搅拌至壳聚糖完全溶解。称取适量的CDI，加入壳聚糖的[BMIM]Cl溶液中，80℃下搅拌反应2 h。再加入适量的PEI，80℃反应2 h。在反应液中加入无水乙醇，过滤，滤液旋转蒸发去除无水乙醇后回收离子液体，滤饼转移至透析袋中（MWCO=8 000～14 000），去离子水透析3 d，冷冻干燥，得到CS-g-PEI。固定CDI和CS的质量比为1，通过改变第2步反应中加入的PEI的量，可以控制PEI的接枝率，得到不同接枝率的CS-g-PEI。采用红外光谱对CS-g-PEI进行结构表征。

1.3.2CS-g-PEI载体基因治疗效果评价基因治疗转染效率采用GFP-N2质粒DNA和pGL3质粒DNA为报告基因，在Hep-2细胞中进行体外评价。用复凝聚的方法制备CS-g-PEI/DNA和CS/DNA纳米复合物。以5×104个/孔的密度将Hep-2细胞接种到24孔板中，在37℃，5%二氧化碳条件下孵育18～24 h后至细胞融合度达到80%。转染前2 h，将完全培养基吸去，用PBS洗涤2次，加入400μl无血清培养基和不同N/P比（质量比）的CS-g-PEI/DNA复合物（每孔含1μg DNA）孵育5 h后，将无血清培养基换成完全培养基。48 h后，在倒置荧光显微镜上观测绿色荧光蛋白表达效果；在酶标仪上检测荧光素酶表达效果，转染效率表示为RLU/mg蛋白。

1.3.3MTT法评价细胞毒性以1×104个/孔的密度将Hep-2细胞接种到96孔板中，在37℃，5%二氧化碳条件下孵育24 h后分别加入20μl CS-g-PEI和CS溶液，以相同浓度的PEI-25作为正对照。培养24 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20μl，37℃继续孵育4 h，终止培养。小心吸取孔内培养上清液后，每孔加入150μl DMSO，在37℃继续孵育30 min。选择570 nm波长，在SUNRISE酶标仪上测定各孔吸光值，检测前自动混匀600 s。细胞活性的表达结果为：细胞存活率（%）=A570（sample）/A570（control）×100，其中A570（sample）为聚合物及其复合物加入的孔的吸光值，A570（control）为只含培养基的孔的吸光值。

2 结果

2.1接枝率

按照接枝率计算公式G=（W1-W0）/W0×100%，得到CS-g-PEI-1，CS-g-PEI-2和CS-g-PEI-3 3个样品的接枝率分别为6.7%、13.5%和39.8%。G：接枝率（%），W0：壳聚糖初始质量（g），W1：接枝共聚物质量（g）。

2.2红外表征

CS-g-PEI和CS的FTIR谱图如图1所示。3 380 cm-1对应于CS结构中O-H、N-H的伸缩振动峰，2 860 cm-1附近为C-H的伸缩振动峰，1 650 cm-1对应于酰胺键中C=O的伸缩振动峰。1 030 cm-1和1 070 cm-1对应于醇羟基的C-O伸缩振动吸收峰，而在1 140 cm-1附近为吡喃环中醚键伸缩振动引起的肩峰。与CS相比，CS-g-PEI1、2、3在2 860 cm-1、1 650 cm-1和1 100 cm-1附近的红外吸收峰强度有明显增加，分别归属于CS-g-PEI中PEI部分C-H伸缩振动、NHCONH中C=O伸缩振动、和C-N伸缩振动的贡献。考虑到所用PEI的分子量为1 800，而透析袋的MWCO范围为8 000～14 000，没有成功共价接枝到壳聚糖骨架的PEI经透析被分离，因此图1中归属为PEI部分的红外吸收峰来自于与壳聚糖共价接枝的PEI部分的贡献。FTIR谱图分析结果表明，PEI与CS发生了共价接枝。随着接枝率的不同，红外光谱也表现出差异。

图1 CS和CS-g-PEI的红外光谱

图2 GFP-N2质粒DNA在Hep-2细胞中的体外转染效果

图3 pGL3质粒DNA在Hep-2细胞中的体外转染效果

图4 CS-g-PEI的MTT细胞毒性评价

2.3载体基因治疗效果评价

在Hep-2细胞中，以GFP-N2质粒DNA为报告基因，评价CS-g-PEI作为非病毒基因载体进行基因治疗的体外转染效果，CS-g-PEI和GFP-N2的N/P比为4，转染结果如图2所示。PEI-25是阳离子聚合物非病毒基因载体转染效率评价的金标准，本研究以PEI-25作为正对照（N/P=4）。从图2可以看出，未进行PEI接枝的CS在Hep-2细胞中的几乎不表现出体外转染，而不同接枝率CS-g-PEI均表

现出较好的转染效率，而随着接枝率的增加，转染效率增高，CS-g-PEI-3的转染效率超过PEI-25。以pGL3质粒DNA为报告基因，对CS-g-PEI的基因转染效率进行定量评价，结果如图3所示。从图3可以看出，转染效率随着N/P的增加而增加，随着PEI接枝率的增加而增加。当N/P比为4时，当接枝率从6.7%增加到13.5%再增加到39.8%时，转染效率从1.2×105增加到1.7×105再增加到2.9×105，转染效率与接枝率不构成严格的正比关系，而是随接枝率增加而显著增加。体外转染结果表明，[BMIM]Cl中均相合成的CS-g-PEI有望成为基因治疗具有应用潜力的壳聚糖基非病毒基因载体。

2.4MTT实验结果

与PEI-25相比，CS-g-PEI均具有较低的细胞毒性，PEI-25的细胞存活率仅为22%，致死量达到78%。而CS-g-PEI的细胞存活率均在80%以上，细胞毒性比PEI-25低约4倍。该MTT细胞毒性评价结果进一步说明，[BMIM]Cl中合成的CS-g-PEI是一种生物安全的壳聚糖基非病毒基因载体，在基因治疗领域具有潜在的临床应用价值。见图4。

3 讨论

本研究在离子液体[BMIM]Cl中均相合成了不同接枝率的CS-g-PEI壳聚糖基非病毒基因载体。通过FTIR对不同接枝率的共聚物进行了结构表征。采用MTT法在Hep-2细胞系中对其基因治疗性能进行了体外转染评价；GPF-N2质粒DNA转染效率评价结果表明，接枝率达到39.8%的CS-g-PEI-3的转染效率超过聚合物转染金标准PEI-25，而MTT毒性评价结果表明，CS-g-PEI的细胞致死量小于20%，其细胞毒性远低于PEI-25。CS-g-PEI有望成为基因治疗临床应用极具潜力的壳聚糖基非病毒基因载体。

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（张蕾 编辑）

Homogeneous synthesis of CS-g-PEI and its application in gene therapy*

Hui-ying CHEN,Jiu-ming ZHANG,Ying HAN,Dan-dan SUN, Shao-hui CUI,Yi-nan ZHAO,Shu-biao ZHANG
(Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization,the National Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,Dalian Nationalities University, Dalian,Liaoning 116600,P.R.China)

【Objective】To graft chitosan with various amount of low molecular weight polyethylenimine (CS-g-PEI)by ionic liquid and obtain a kind of efficient and safe chitosan based non-viral gene vectors.【Methods】CS-g-PEI copolymers with various graft ratios were homogeneously synthesized using ionic liquid 1-butyl-3-methyl imidazolium chloride[(BMIM)Cl]as the reaction solvent and 1,1-carbonyldiimidazole(CDI) as the coupling reagent.The structures were confirmed by FTIR.The transfection performance was evaluated in Hep-2 cell line in vitro.【Results】CS-g-PEI copolymers synthesized by ionic liquid[(BMIM)Cl]improved gene transfection efficiency and had low cytotoxicity.【Conclusion】The synthetic CS-g-PEI copolymers have good potential in gene therapy as non-viral gene vector candidates.

gene therapy;ionic liquid;chitosan;PEI;graft-copolymer

R945；O636.9

A

1005-8982（2015）24-0001-04

2015-03-05

国家863高新技术研究发展计划（No：2014AA020707）；国家自然科学基金（No：21176046）；大连民族大学中央高校自主科研基金；大学生创新创业训练计划（No：X201403051）

张树彪，E-mail：zsb@dlnu.edu.cn，Tel：0411-87656430