外源植酸酶对野鸭湖湿地土壤有机磷转化的影响研究

曲博，李敏*，其美，朱芸芸，赵暾，孙晓建

1. 北京林业大学环境科学与工程学院，北京 100083；2. 北京基亚特环保科技有限公司，北京 100085

外源植酸酶对野鸭湖湿地土壤有机磷转化的影响研究

曲博1，李敏1*，其美1，朱芸芸1，赵暾1，孙晓建2

1. 北京林业大学环境科学与工程学院，北京 100083；2. 北京基亚特环保科技有限公司，北京 100085

湿地土壤中最主要的有机磷形态是肌醇磷酸盐，占有机磷总量的 60%左右，而植酸酶作为催化水解肌醇磷酸盐的主要酶类，在整个有机磷体系转化过程中起着不可或缺的作用。采用室内培养的方法，研究了添加外源植酸酶对湿地土壤各有机磷组分含量变化的影响规律，同时也研究了在添加外源植酸酶后，湿地土壤各有机磷组分含量随时间延长的变化规律。结果表明，在温度，水分等条件适宜的情况下向湿地土壤中添加植酸酶可以在短期内提高土壤有机磷的有效性，使稳定性较高的有机磷向活性较高的有机磷转化。经植酸酶处理的土壤活性有机磷和中活性有机磷含量均高于对照组，且随植酸酶添加量增加以及培养时间的推移呈递增趋势。在第75天培养结束时，高、中、低3组植酸酶处理土壤的活性有机磷质量分数分别增加了173.05%、158.16%和122.75%，中活性有机磷质量分数增加了84.22%、68.7%和53.92%。此外，添加植酸酶处理的湿地土壤稳定性有机磷含量均低于对照，高、中、低3组植酸酶处理土壤的中稳定性有机磷质量分数减少了62.81%、37.31%和26.14%，高稳定性有机磷质量分数减少了94.71%、87.66%和79.52%，且随着植酸酶含量的增加以及培养时间的推移呈递减趋势。高、中、低3组植酸酶处理土壤中的总有机磷质量分数分别比对照组低54.03%、42.53%和35.43%。说明在植酸酶作用下，土壤中存在有机磷向无机磷转化的过程。因此通过添加外源植酸酶可以促进稳定性有机磷向活性有机磷转化，提高了土壤有机磷的有效性，使其更容易被植物吸收利用，从而保障了湿地磷循环系统的稳定性和高效性。

植酸酶；湿地土壤；有机磷组分；野鸭湖湿地

湿地土壤中的磷主要有无机磷和有机磷，有机磷作为土壤中磷的重要组成部分，一般占总磷的15%～80%（屈凡柱等，2012），并且部分有机磷在特定酶或微生物的作用下，能够矿化或分解成无机磷，被植物吸收利用，是潜在的磷源（孙桂芳等，2011）。然而有机磷种类繁多，成分复杂，由于分析条件的限制，关于有机磷分级和提取方法不尽一致。不同活性有机磷的连续提取的方法首先被Bowman和Cole（1978）提出，随后被Hedley等（1982）、Sharpley和Smith（1992）、Ivanoff等（1998）、Fan等（1999）、Fisher（2007）不断改进，大多数学者按照有机磷在不同提取剂中的溶解能力将其分为活性有机磷（L-OP）、中等活性有机磷（ML-OP）、中等稳定有机磷（MR-OP）和高稳定有机磷（HR-OP）（Turner等，2005）。土壤中构成有机磷的主要组分为稳定性有机磷，活性有机磷所占比例很小（于群英和李孝良，2003；冯跃华等，2001；刘小虎等，1999；黄庆海等，2003；向春阳等，2005）。研究发现，活性和中等活性有机磷为易被植物吸收的组分（来璐等，2003）。

植酸酶作为磷酸单酯水解酶的一种，是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称。植酸类有机磷约占土壤有机磷的 40%～80%，植物可以直接吸收一部分植酸类有机磷，也可在植酸酶的作用下分解释放出无机磷为植物提供磷源。目前，植酸酶已经被广泛应用于饲料业和食品加工业，用来降解饲料中的植酸，使其释放出无机磷及与植酸结合的蛋白质、微量元素等，此项应用已得到国内外人士的广泛认同（钟国清，1999）。

考虑到植酸酶可以提高土壤有机磷素的有效性，本文采用室内模拟培养法，设计了短期与长期实验方案，分别研究了在不同条件下外源植酸酶对湿地土壤各有机磷组分含量的影响规律，以期为提高湿地土壤有效磷含量，增加湿地植物的磷利用率及为缓解湿地水体富营养化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

野鸭湖湿地位于北京市延庆县西北部，地理位置处于北纬40°22′04″～40°30′31″，东经115°46′16″～115°59′48″，是由官厅水库延庆辖区及环湖淹没区组成的滩涂和库塘等组成的次生湿地，西南部与河北怀来县接壤。野鸭湖湿地是北京地区最大的湿地保护区，湿地面积达3939 hm2。本区原为延庆盆地东部妫水河、蔡家河下游，1955年建成官厅水库，形成巨大的人工湖泊湿地。保护区处于水库中上游，沟岔纵横，库湾众多，形成很多芦苇沼泽和湿地草甸。保护区包括妫水河下游河流、人工湖泊、沼泽及两岸部分季节性种植及搁荒农田。

实验采用野鸭湖湿地土壤，基本理化性质：pH值为8.03，含水率为38.57%，有机质为30.78 g·kg-1，全氮为1.86 g·kg-1，全磷为638.2 mg·kg-1。供试植酸酶选自目前在饲料中广泛使用的酶制剂，酶活性为5000 U·g-1。

1.2 试验设计

短期试验设计：设置6组处理，准确称取5 g供试土样，放入100 mL锥形瓶中，分别称取0、0.05、0.1、0.2、0.5、1 g植酸酶（酶活性为5000 U的固态植酸酶）溶于50 mL蒸馏水中。把溶解好的植酸酶溶液加入到盛有土样的锥形瓶中，将锥形瓶放入震荡箱恒温37 ℃下震荡24 h后取出过滤。对照组为不加植酸酶的土样。每组设置3个平行样，对培养前后土壤中各有机磷组分进行测定。

长期试验设计：设置4组处理：1）对照；2）低量植酸酶；3）中量植酸酶；4）高量植酸酶。其中对照为不施加植酸酶处理，低、中、高量植酸酶处理是分别将0.1、1、10 g植酸酶搅拌均匀加入到500 g试样土壤里。于常温恒湿（保持水分在田间持水量的60%）条件下培养75 d，并分别在培养的不同阶段（每隔10 d）取样，每组取3个平行样，对土壤各有机磷组分进行测定。

有机磷组分的测定：本文在参考Bowman and Cole（1978）、Ivannoff等（1998）、Fisher（2007）、Turner等（2005）提出的方法的基础上，对有机磷连续提取方法进行改进，将有机磷分为活性有机磷（L-OP）、中活性有机磷（ML-OP）、中稳定性有机磷（MR-OP）、高稳定性有机磷（HR-OP）。每一种有机磷的测定都是通过差减法求得，土壤总有机磷含量由各有机磷组分含量相加而得。

1.3 数据处理

采用Excel 2013对原始数据进行整理、统计和计算；采用OriginPro 8进行数据作图。

2 结果与讨论

2.1 植酸酶添加量对湿地土壤各有机磷组分含量的影响

图1显示了添加不同量的植酸酶对土壤有机磷组分含量的影响。从图1可见，与对照组相比，短期试验中，各组土壤活性与中活性有机磷含量均有增加，中稳定性有机磷与高稳定性有机磷含量均有下降，且随着植酸酶添加量的增加，土壤中活性有机磷组分的含量越来越高，稳定性有机磷组分的含量则越来越低。活性有机磷增幅为 19.72%～134.9%，中活性有机磷增幅为12.73%～47.82%，中稳定性有机磷减幅为 7.94%～25.86%，高稳定性有机磷减幅为3.61%～38.87%。

图1 植酸酶添加量对湿地土壤中各有机磷组分含量的影响Fig. 1 Effect of phytase contents on organic phosphorus frictionsin Wetland soil

2.2 外源植酸酶对湿地土壤各有机磷组分含量的长期影响

2.2.1 外源植酸酶对湿地土壤活性有机磷组分含量的长期影响

图2 湿地土壤活性有机磷含量随植酸酶添加量及培养时间的变化Fig. 2 Variation of labile organic P consent with phytase added quantity and incubation time in Wetland soil

图2表达了添加不同量的植酸酶对土壤活性有机磷组分含量的长期影响。从图2可知，不添加植酸酶的对照土样活性有机磷随着时间变化其含量基本不变，而经过不同含量植酸酶处理的土样活性有机磷含量均高于对照。当培养时间相同时，土壤活性有机磷含量随植酸酶添加量的增高而增加。此外对于相同植酸酶添加量的实验组，土壤活性有机磷含量则随培养时间的延长而增加。在75 d培养结束时，高、中、低3组植酸酶处理的土壤活性有机磷质量分数分别增加了 173.05%、158.16%和122.75%。占同时期同比总有机磷的21.11%、16.57%和12.78%，而对照组土壤活性有机磷质量分数仅占有机磷总量的3.66%，与培养前基本一样。

图3是添加不同量的植酸酶对土壤中活性有机磷组分含量的长期影响。从图3可知，不添加植酸酶的对照土样中活性有机磷随着时间变化其含量基本不变，而经过不同含量植酸酶处理土样的中活性有机磷含量均高于对照。当培养时间相同时，各土壤的中活性有机磷含量随着植酸酶添加量的增加而增加，对于相同植酸酶添加量的实验组，各土壤中活性有机磷含量则随培养时间的延长而增加。在整个培养结束时，高、中、低3组植酸酶处理的土壤中活性有机磷质量分数分别增加了 84.22%、68.7%和 53.92%。占同时期同比总有机磷的41.33%、30.49%和 24.97%，对照组土壤中活性有机磷质量分数仅占有机磷总量的10.71%，与培养前差不多。

图3 湿地土壤中活性有机磷含量随植酸酶添加量及培养时间的变化Fig. 3 Variation of moderately labile organic P consent with phytase added quantity and incubation time in Wetland soil

高活性有机磷主要是核酸、磷脂类、磷糖类化合物，结果说明在植酸酶水解稳定性有机磷的同时产生了部分活性有机磷，磷脂就是水解过程的主要产物之一。植酸在土壤中不仅仅是以肌醇六磷酸的形式存在，它与土壤中的金属离子结合会形成肌醇六磷酸盐，而肌醇磷酸盐的稳定性与他们对金属离子的络合能力有关（Nolan和Duffin，1987），植酸钙、镁等化合物相对于植酸铁、铝等化合物稳定性较差，属于中活性有机磷。结果表明在植酸酶催化水解的过程中，对部分肌醇六磷酸与金属离子的络合能力也产生了影响。从时间上看，各土壤活性有机磷在培养第 50天后增加的趋势都趋于平缓，说明在整个培养过程中土壤活性有机磷的含量在达到一定时间后不会随着植酸酶含量的增加而继续大幅增加，即外源植酸酶对土壤活性有机磷含量的影响在一段时间后慢慢变小。

2.2.2 外源植酸酶对湿地土壤稳定性有机磷组分的长期影响

图4表达了添加不同量的植酸酶对土壤中稳性有机磷组分含量的长期影响，从图4可见，对照组土样的中稳定性有机磷含量随着时间推移并不是一成不变的，而是表现出约14%的小幅增加，说明可能存在高稳定有机磷向中稳定有机磷的转化，这一点从下文中关于高稳定性有机磷的实验数据中也可以反映出来（图5）。经不同含量植酸酶处理土样的中稳定性有机磷含量均低于对照，各土壤的中稳定性有机磷含量随着植酸酶添加量的增加及培养时间的延长而减少。高、中、低3组植酸酶处理土壤的中稳定性有机磷含量均在培养 40 d后趋于稳定，在培养结束时，高、中、低3组植酸酶处理土壤的中稳定性有机磷质量分数分别减少62.81%、37.31%和 26.14%。占同时期同比总有机磷的31.72%、41.15%和 45.78%，对照组土壤的中稳定性有机磷质量分数占有机磷总量的42.46%。

图4 湿地土壤中稳定性有机磷含量随植酸酶添加量及培养时间的变化Fig. 4 Variation ofmoderately resistant organic P consent with phytase added quantity and incubation time in Wetland soil

图5为添加不同量的植酸酶对土壤高稳性有机磷组分含量的长期影响。从图5可知，对照组土样高稳定性有机磷含量随着时间推移而逐渐减少，减少量为22.07%。由于植酸酶广泛存在于真菌、酵母、绝大多数细菌和植物中（李晓龙等，2010），因此，湿地土壤中存在的大量微生物可能会产生植酸酶，进而作用与土壤中的高稳定有机磷，使其含量降低。经植酸酶处理土样的高稳定性有机磷含量均低于对照，各土壤高稳定性有机磷含量也呈现出随植酸酶添加量的增加而减少的趋势，尤其中量和高量植酸酶处理土壤在培养初期下降趋势极其明显。在75 d培养结束时，高、中、低3组植酸酶处理土壤的高稳定性有机磷质量分数分别减少了 94.71%、87.66%和 79.52%，占同时期同比总有机磷的5.84%、12.22%和16.48%，对照组土壤的稳定性有机磷质量分数则占有机磷总量的43.17%。

土壤中最重要的有机磷形态是肌醇磷酸盐，占有机磷总量的60%。而肌醇磷及其衍生物的生物有效性是不同的，据研究（Cosgrove，1967；Jackman和 Black，1951）表明，随着磷酸根在肌醇上的数目增加，肌醇磷酸盐的活性降低，也就是说磷酸根数目多的肌醇磷酸盐更具有稳定性。而稳定性有机磷中大量存在着肌醇五磷酸盐和肌醇六磷酸盐，这些稳定性较高的有机磷被植酸酶逐步水解释放无机磷的同时也逐步降低了有机磷的稳定性。

从图4、图5还可见，中稳定性有机磷含量的减少并没有高稳定性有机磷大，这说明植酸酶主要作用于肌醇六磷酸盐这类高稳定性的有机磷，水解释放出磷酸根离子，并使高稳定性有机磷含量明显降低；同时，也说明植酸酶也会作用于一些其它种类的磷酸单酯，使得中稳定性有机磷含量有所减少。植酸酶按照其结构和催化机理可分为4大类（李晓龙等，2010）：组氨酸酸性磷酸酶植酸酶（HAPhy）、β-螺旋桨植酸酶（BPP）、半胱氨酸磷酸酶植酸酶（CPhy）和紫色酸性磷酸酶植酸酶（PAPhy），其中，HAPhy是目前所知最广泛存在的植酸酶类群，这类酶可以催化水解多种磷酸单酯底物，对植酸的特异性并不高，这一点也正好解释了我们的实验结果。

图5 湿地土壤高稳定性有机磷含量随植酸酶添加量及培养时间的变化Fig. 5 Variation of highly resistant organic P consent with phytase added quantity and incubation time in Wetland soil

2.3 外源植酸酶对湿地土壤总有机磷含量的长期影响

由图6可见，对照土样的总有机磷含量在培养前期基本保持不变，到第 60天时略有降低。经过植酸酶处理土样的总有机磷含量均低于对照组，且呈现植酸酶添加量越大，土壤总有机磷含量越低的趋势。从图6还可见，随培养时间的延长，添加植酸酶的土壤中总有机磷含量持续下降，而总磷质量分数维持在403.37～414.45 mg·kg-1，到第75天时，低量、中量和高量植酸酶处理土壤中的总有机磷质量分数分别比对照组低35.43%、42.53%和54.03%。说明添加植酸酶可显著促进湿地土壤中的有机磷组分水解转化为无机磷组分。在培养初期，即第10天时，高量和中量植酸酶处理土壤的总有机磷含量下降明显，而后下降趋势有所减缓，到第 50天以后，土壤总有机磷含量基本不变。相比之下，低量植酸酶处理土壤的总有机磷含量在培养初期降低较少，但随培养时间延长总有机磷含量一直降低，到第 75天时，土壤总有机磷含量已接近中量植酸酶处理土壤，说明低量植酸酶对土壤有机磷具有缓慢而持续的催化水解作用。从图6还可见，连续培养60 d后，高、中、低量植酸酶处理土壤的总有机磷含量基本不再变化，且3组处理土壤的总有机磷含量接近，说明此时土壤中仍然存留部分无法被植酸酶水解的有机磷组分，这部分有机磷可能是其它的磷酸单酯或磷酸二酯成分。

图6 外援植酸酶对湿地土壤总有机磷含量的影响Fig. 6 Effect of outside source of phytase on contents of total organic P in Wetland soil

3 结论

1）短期实验与长期实验中各有机磷组分含量变化趋势基本一致，都是活性有机磷含量随着植酸酶添加量的增加而增加。在75 d培养结束时，高、中、低3组植酸酶处理土壤的活性有机磷质量分数分别增加了173.05%、158.16%和122.75%，中活性有机磷质量分数增加了84.22%、68.7%和53.92%。稳定性有机磷含量则随着植酸酶添加量的增加而减少，高、中、低3组植酸酶处理土壤的中稳定性有机磷质量分数分别减少了 62.81%、37.31%和26.14%，高稳定性有机磷质量分数分别减少了94.71%、87.66%和79.52%。

2）向湿地土壤中施加外源植酸酶可以促进土壤稳定性有机磷向活性有机磷和无机磷的转化。因此，土壤总有机磷含量逐渐降低，培养至第 75天时，高、中、低3组植酸酶处理土壤的总有机磷质量分数分别比对照组低54.03%、42.53%和35.43%。

3）植酸酶参与的催化反应为水解反应，是一个比较缓慢的过程，通过增加植酸酶的添加量可以提高水解效率，整个过程在培养至第60天后基本稳定。

4）施加外源植酸酶对湿地土壤中稳定性较高的有机磷进行水解矿化，在本试验条件下是可行的。这对于提高湿地土壤有效磷含量，增加植物的磷利用率及为缓解湿地水体富营养化具有积极意义。

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Effects of Soil Organic Phosphorus Transformation on Fertilizing Outside Source of Phytase in Yeyahu Wetland

QU Bo1, LI Min1*, QI Mei1, ZHU Yunyun1, ZHAO Tun1, SUN Xiaojian2
1. College of Environmental Science & Engineering, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Beijing G&T Environmental Protection Science and Technology Co. Ltd., Beijing 100083, China

Inositol phosphates were as the main form of wetlands soil organic phosphorus, comprising up to 60% of organic P, and it can be catalyzed by phytases into phytic acid and inorganic phosphorus. Wetlands soil incubation was carried out to study the influences of organic phosphorus fractions and quantity in different periods after application of outside source of phytase. The results were concluded: the effectiveness of organic P can be improved by phytases under the appropriate conditions for short periods. The outside source of phytase increased the contents of labile, moderately labile organic P in soil which is higher than CK. During the cultivation of the 75 days periods, the labile organic P contents of experimental soil increased by 173.05%, 158.16%, and 122.75%, respectively, and the contents of moderately labile organic P increased by 84.22%, 68.7% and 53.92%, respectively, after each treatment. In addition, the contents of moderately resistant and highly resistant organic P when added phytases were lower than that of CK. The moderately resistant organic P contents of experimental soil decreased by 62.81%, 37.31% and 26.14%, respectively, and the contents of highly resistant organic P decreased by 94.71%, 87.66%and 79.52%, respectively, and it show a downward trend with increase of phytases contents and time passing. The contents of total organic P also decreased by 54.03%、42.53%and 35.43%, respectively than CK, under the effects of phytases. Therefore, Phytases could promote the changes of organic P fractions and increase the availability of soil organic P. To make it more easily to be absorbed by the plant, so as to guarantee the stability and high efficiency of the wetland phosphorus cycle system.

phytase; wetlands soil; organic phosphorus frictions; Yeyahu wetland

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.02.011

S154.2

A

1674-5906（2015）02-0250-05

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国家自然科学基金项目（51279004）；人事部留学基金委择优资助项目（优秀项目类）

曲博（1988年生），男，硕士，主要研究方向为污染物迁移转化、水体生态修复。E-mail: qubo19881@126.com *通信作者

2014-11-02