PHA高产菌株发酵条件优化研究

王 悦，孙金旭，朱会霞



PHA高产菌株发酵条件优化研究

王 悦，孙金旭，朱会霞

(衡水学院 生命科学学院，河北 衡水 053000)

以筛选出的生物环保材料PHA高产菌株SJ-9为初始菌株，对其发酵培养条件进行优化，以丁酸钠、碳氮比例、pH、温度、转速、装液量、误差7种因素，利用L18(37)正交试验设计进行条件优化，经实验得出适宜的发酵条件组合为：丁酸钠为2 g/L，碳氮比例为40，pH为7.5，温度为26℃，转速为150 r/min，装液量200mL/L．此条件下，PHA产量为3.31g/L．相对其未优化条件产量提高46.5 %．

PHA；发酵；优化；正交实验

传统的高分子材料大多来源于石油化工，其大规模的生产加速了不可再生资源的利用，及其耐耗性也造成日趋严重的环境危害．聚烃基脂肪酸酯(PHA)作为一种新型的高分子材料，它的合成原料为糖、脂肪酸等可再生资源，并且具有生物可降解性和生物可相容性等独特优点．这些特性可以有效地缓解资源紧张以及环境污染的现状[1]．

因此近几十年来，PHA的研究被各国所重视，其制品被应用于塑料、医学等各种领域[2-3]．其中，微生物大规模发酵法是获取PHA的主要生物途径，在国内外均有大量研究，现阶段限制PHA发展应用的主要因素为优势菌种少、PHA产量过低、成本过高．因此，筛选PHA高产菌株以提高PHA产量势在必行．本研究就实验室现有的已筛选出的PHA高产菌株SJ-9[4]基础上，对其培养发酵条件进行优化，以期提高PHA产量．

1 材料与实验方法

1.1 PHA高效生产菌株SJ-9

衡水学院微生物实验室筛选保藏．

1.2 实验仪器

气相色谱仪(Agilent GC7890)；红外光谱仪(AVTAR36O)美国热电尼高力公司；恒温摇床(ZHWY-2112B)上海智诚分析仪器制造有限公司．

1.3 PHA提取与测定

氯仿提取与气相色谱分析测定[4]．

1.4 发酵培养基的正交试验设计

为优化发酵培养基的条件，选取一定量的高产菌SJ-9采用正交实验法，选用对生产PHA的微生物合成能产生影响的碳源、碳氮比、初始pH值、培养温度、转速、装液量为试验因素，各取3水平因素不同含量，以PHA产量(g/L)为参考指标，进行L18(37)正交实验安排，具体设计见表1．

表1 因素位级表

2 结果分析

对以PHA产量(g/L)为目的产物进行正交实验结果以及方差分析，具体实验数据见表2、表3．

表2 正交实验设计及结果

表3 正交实验方差分析表

注：* 表示具有显著性.

由正交实验结果可以得出，极差的大小顺序为B﹥D﹥E﹥A﹥F﹥C，即影响PHA产率的7种因素的主次依次是碳氮比﹥温度﹥转速﹥丁酸钠﹥装液量﹥pH，其中碳氮比对PHA产率的影响最大，初始pH的浓度影响最小．比较3个因素不同水平下的综合，发现A2、B3、C3、D1、E2、F2、G2条件下PHA的产量最高，产量为3.31 g/L．

由方差分析结果可以得出碳氮比与温度的比值大于临界值19，分别为76.59与22.936，表明碳氮比与温度对PHA的产率具有显著性，并且各因素间的重复性差异极其显著，说明实验数据可信．方差分析显示各因素对PHA的产率均有影响．

已有的研究得出，PHA颗粒数目在细胞积累初期就已固定，即PHA的积累与菌体量是同步进行、同步完成的[3]．碳源与氮源是合成细胞的基础物质，本次实验表明，碳氮比对PHA的产率具有显著性，也就进一步验证底物对合成PHA的重要性．此次实验的最佳条件是碳氮比为最大40时，也验证了，合适的限氮条件可以增加PHA在细胞中的积累[5-6]．在菌种的培养条件中，温度为最主要的一种，选择合适的温度不仅可以加速酶的活性，而且可以使菌种维持稳定的生长状态，温度过高或多低，都会影响酶的活性，甚至会杀死菌细胞．

在实验范围内，PHA高产菌株SJ-9的最佳发酵培养条件为：丁酸钠为2 g/L，碳氮比例为40，pH 为 7.5，温度为26 ℃，转速为150 r/min，装液量200 mL/L．PHA产量为3.31 g/L．

3 结论

本实验以PHA产量为指标对SJ-9菌株发酵培养条件利用L18(37)正交实验设计进行条件优化，经实验得出，适宜的发酵条件组合为：丁酸钠为2 g/L，碳氮比例为40，pH 为 7.5，温度为26 ℃，转速为150 r/min，装液量200 mL/L．此条件下，PHA产量为3.31 g/L．相对未优化条件下的产量提高46.5 %．其中，碳氮比对PHA产率的影响最大，同时温度对PHA的产率的影响也具有显著性．

[1] 陈国强.生物高分子材料聚羟基脂肪酸脂(PHA)开发现状及产业化前景分析[J].化工新型材料,2010,38(10):1-7.

[2] 张瑞和.我国全降解塑料产业化的进程[J].中国环保产业,2005(1):39-41.

[3] ANDERSON A J, DAWES E A. Ocurrene, metabolism, metabolic roll and industrial uses of bacterial polyhy droxyalkanoates[J]. Microbilol,1990,54:450-472.

[4] 朱会霞.PHA生产菌株的筛选及生长特性研究[J].China Brewing,2011,236(11):54-57.

[5] 陈志强,田婷,温沁雪,等.限氮和限磷对活性污泥合成聚羟基烷酸的影响[J].环境工程学报,2010(4):771-775.

[6] MADISON L L, HUISMAN G W. Metabolic engineering of poly (3- hydroxyalkanates): from DNA to plastic [J]. Microbiol Mol Biol Rev,1999,63:21- 53.

Optimization of Fermentation Conditions for High-producing Strain of PHA

WANG Yue, SUN Jin-xu, ZHU Hui-xia

(College of Life Science, Hengshui University, Hengshui, Hebei 053000, China)

With the selected high-producing strain SJ-9 of the biological environmental protection material PHA as the initial strain, the fermentation and culture conditions are optimized with L18(37) orthogonal experiment, in terms of sodium butyrate, PH, temperature, rotate speed, loaded liquid and error. The experiment shows that the appropriate fermentation condition is got when sodium butyrate is 2 g/L, the ratio of carbon and nitrogen is 40, pH is 7.5, temperature is 26 ℃, rotate speed is 150 r/min and the loaded liquid is 200 mL/L. Under this optimized condition, the PHA production is 3.31 g/L which is increased by 46.5 % when compared to former conditions.

PHA; fermentation; optimization; orthogonal experiment

(责任编校：李建明 英文校对：李玉玲)

10.3969/j.issn.1673-2065.2015.01.010

Q93-331

A

1673-2065(2015)01-0033-03

2014-09-22

河北省科技厅资助课题 (10215522)

王 悦(1985-)，女，河北衡水人，衡水学院生命科学学院助教，工学硕士；

孙金旭(1975-)，男，河北景县人，衡水学院生命科学学院副教授，工学博士．