人参皂苷Rd对高糖致人牙周膜干细胞成骨分化抑制作用的影响

王慧丽，谢 冰，李 欣，蔺燕萍，张 朋

1)郑州大学附属郑州中心医院口腔科 郑州450007 2)郑州大学口腔医学院修复科 郑州450052

△女，1974年12月生，本科，主治医师，研究方向:牙体牙髓牙周病，E-mail:wanghl501@163．com

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周组织中存在的未分化的间充质细胞，具有自我更新和多向分化等特点。21 世纪以来，糖尿病已成为世界各国共同面对的一项公共健康问题，而糖尿病会大大增加牙周炎的发病率［1］。人参皂苷Rd (ginsenoside Rd，GSRd)是人参皂苷的主要活性单体之一，具有广泛的生物活性，如保护心血管及肾脏功能、促进细胞生长等［2-3］。作者观察了高糖诱导条件对PDLSCs 增殖及分化的影响，进一步分析GSRd 对高糖诱导PDLSCs 成骨分化的影响，报道如下。

1 材料与方法

1．1 试剂及仪器 胎牛血清、2．5 g/L 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、Dispase 酶(HyClone 公司，美国)，GSRd(广东泰和生物制药有限公司)，α 极限必需培养基(α-MEM)、Trizol Reagent(Invitrogen 公司，美国)，骨桥蛋白(OPN)抗体、超氧化物歧化酶(SOD)抗体、过氧化氢酶(CAT)抗体、内参抗体、羊抗兔抗体(Abcam 公司，美国)，逆转录试剂盒、即用型混合液(Roche 公司，瑞士)，倒置显微镜(Olympus 公司，日本)，酶联免疫检测仪(Biorad 公司，美国)，PCR 仪(Aplied Biosystems 公司，美国)。

1．2 PDLSCs 的分离、培养及实验分组 经患者知情同意后，取根中1/3 牙周膜组织，剪成约1 mm×1 mm×1 mm 的组织块，移入15 mL 离心管，加入3 g/L 的Ⅰ型胶原酶和4 g/L 的Dispase 酶，37℃消化1 h。将细胞移于含体积分数10%胎牛血清、青霉素及链霉素各1 ×105U/L 的α-MEM 培养液重悬。调整细胞密度为1 ×107L－1，接种于6 孔板，置于37℃、体积分数5%CO2孵箱中。每3 d 换液1次，弃去未贴壁的细胞。细胞达80%左右融合时，用胰蛋白酶消化传代。实验均取第4～7 代细胞，均重复6次。观察高糖对碱性磷酸酶(ALP)活性影响时，设对照组和高糖组，观察时间为第4、7天;观察正常条件下GSRd 对ALP 活性的影响时，设对照组和0．1、1．0、10．0、40．0、100．0 μmol/L GSRd 处理组;观察高糖条件下GSRd 对ALP、骨钙蛋白(OCN)、OPN、SOD、CAT 表达的影响时，设高糖组、对照组和高糖+10(或40)μmol/L GSRd 处理组，ALP 活性检测时间为第4、7、14天。

1．3 PDLSCs 表面标记物的检测 取第4 代PDLSCs，2．5 g/L 胰蛋白酶消化并离心，弃上清液，用冷PBS 洗3次后再用含体积分数30%的胎牛血清的PBS 重悬，调细胞密度至2 ×109L－1;将细胞悬液分装于EP 管中(100 μL/管)，设定其中一管为裸细胞作为对照，其余分别加入相应的抗体2 μL，室温避光孵育1 h，离心弃上清后冷PBS 洗3次，用500 μL 含体积分数30%胎牛血清的PBS 重悬，4℃避光保存。用流式细胞仪检测CD34、CD29、CD90、CD45、CD146 等表面标记物的表达情况。

1．4 PDLSCs 的成骨分化 将PDLSCs 转移到含体积分数5%胎牛血清的α-MEM 培养基，培养基同时含50 mg/L 抗坏血酸、1 μmol/L 地塞米松及3 mmol/L β-磷酸甘油。细胞孵育时分别添加5 mmol/L D-葡萄糖(正常组)或30 mmol/L D-葡萄糖(高糖组);GSRd 浓度分别为0．1、1．0、10．0、40．0、100．0 μmol/L。培养基每2 d 换液1次。

1．5 ALP 活性测定 细胞用PBS 洗涤2次并溶解在含体积分数1% Triton X-100 和1 mmol/L PMSF的Tris-HCl 缓冲液(pH 7．0)中。使用Bradford 方法进行总蛋白定量，在405 nm 波长处测吸光度值，并用总蛋白标准化ALP 活性。

1．6 ALP、OCN、SOD、CAT mRNA 表达的检测用Trizol Reagent 提取细胞总RNA。ALP 上游引物5'-GCAGTATGAATTGAATCGGAACAAC-3'，下 游 引物5'-ATGGCCTGGTCCATCTCCAC-3';OCN 上游引物5'-ACCATCTTTCTGCTCACTCTGCT-3'，下游引物5'-CCTTATTGCCCTCCTGCTTG-3';SOD 上游引物5'-TCAATCAAGAGGGTGAAAAGAAGCC-3'，下游引物5'-TGACAAAGTTAGCATTGCATCCTCG-3';CAT 上游引物5'-AGCGACCAGATGAAGCAGTG-3'，下游引物5'-TCCGCTCTCTGTCAAAGTGTG-3';内参β-actin 上游引物5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。将每个样本的总RNA(1 μg)逆转录为cDNA。反应体系的体积为20 μL，包括10 μL 2 ×FastStart Universal SYBR Green Master、1 μL cDNA、0．5 μL 上游引物、0．5 μL 下游引物及8 μL 双蒸水。反应条件为:94℃预变性2 min;94℃15 s，56℃10 s，72℃30 s，共39个循环;72℃延伸8 min，并采用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1．7 OPN、SOD、CAT 蛋白表达的检测 将提取的总蛋白(20 μg)使用100 g/L 的SDS-PAGE 分离胶分离，并转移到NC 膜。TBST 洗膜，50 g/L 脱脂奶液封闭1 h。滴加一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜，滴加二抗孵育1 h，TBST 洗膜，曝光。采用Image J 图像分析软件测定蛋白条带的灰度值。

1．8 统计学处理 采用SPSS 17．0 进行数据分析。对照组和高糖组ALP 活性的比较采用两独立样本的t检验;其他指标不同组间的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 PDLSCs 的形态学观察 牙周膜组织用酶消化法培养3～7 d 后，可见长梭形、多角形的类成纤维样细胞从组织块中爬出，2 周左右达70%～80%融合(图1)。

图1 PDLSCs 形态(×100)

2．2 PDLSCs 表面标记物鉴定结果 PDLSCs 表面标记物阳性表达率为:CD90 (99．32 ± 0．03)%、CD29 (98．35 ±0．05)%、CD146 (93．38 ±0．02)%、CD34 (2．77 ±0．01)%、CD45 (2．21 ±0．01)%，符合间充质干细胞表达特点。

2．3 高糖对PDLSCs ALP 活性的影响 结果见表1。

表1 高糖对PDLSCs ALP 活性的影响 mol/g

2．4 GSRd 对PDLSCs ALP 活性的影响 结果见表2、3。

表2 正常条件下GSRd 对PDLSCs ALP 活性的影响 mol/g

表3 高糖条件下GSRd 对PDLSCs ALP 活性的影响 mol/g

2．5 GSRd 对高糖诱导PDLSCs 成骨相关因子ALP、OCN、OPN 表达的影响 结果见表4。

2．6 GSRd 对高糖诱导PDLSCs SOD、CAT 表达的影响 结果见表5。

表4 GSRd 对高糖诱导PDLSCs ALP、OCN 及OPN 表达的影响

表5 GSRd 对高糖条件下CAT、SOD mRNA 及蛋白表达的影响

3 讨论

流行病学研究［4-5］发现糖尿病与牙周病之间的关联度很高，甚至牙周炎被提议作为糖尿病的第六并发症。糖尿病患者的高血糖水平可以改变PDLSCs 的再生能力，从而影响牙周组织的修复和再生。在该研究中，作者首先证实高糖条件对PDLSCs成骨分化的抑制效应，在高糖组的第4 和7天，ALP的活性较对照组显著下降，预示着高糖减低了PDLSCs 的成骨活性。接着，作者对PDLSCs 应用GSRd 进行预处理，发现10、40 μmol/L GSRd 抑制了由高糖诱导的ALP 活性的下降，改善了高糖条件下PDLSCs 成骨分化的能力，提示GSRd 可以用于治疗伴糖尿病型牙周炎。

为了进一步探讨GSRd 在高糖对PDLSCs 成骨分化影响中的作用，作者通过PCR 检测发现成骨基因ALP 和OCN 表达量在高糖条件下较对照组显著下降，而应用10、40 μmol/L GSRd 预处理后ALP 和OCN mRNA 的表达量较高糖组显著提高。同样通过免疫印迹的方法作者发现，高糖组OPN 蛋白表达量较对照组显著下降，应用10、40 μmol/L GSRd 预处理后OPN 蛋白表达量较高糖组升高。ALP、OCN、OPN 被认为是组织发生矿化［6］、成骨细胞活性［7］的重要指标。这些结果说明GSRd 对高糖致PDLSCs成骨分化抑制起到了改善作用。

伴糖尿病型牙周炎患者的PDLSCs 长期暴露在高浓度葡萄糖中，会诱导细胞的氧化应激反应加剧，从而产生不利影响，使后期缺损牙槽骨的再生能力减弱。因此，去除氧化的因素及提高抗氧化酶的表达和活性可能会有利于伴糖尿病型牙周炎患者牙周组织的再生。在该研究中作者发现，高糖组PDLSCs 抗氧化酶CAT 及SOD 的mRNA 和蛋白表达量较对照组显著下降，而应用10、40 μmol/L GSRd 预处理后mRNA 和蛋白的表达量较高糖组升高。这些结果与以前的研究［8-11］结果类似，表明GSRd 可以提高抗氧化酶的表达和活性，进而起到清除氧自由基的作用。

综上，作者发现GSRd 对体外培养的PDLSCs 的成骨分化有一定的促进作用，且GSRd 可以减轻高糖条件下氧化应激对PDLSCs 成骨的抑制作用，显著改善高糖状态下ALP、OCN mRNA 及OPN 蛋白表达量的降低，进而对高糖条件下PDLSCs 的成骨分化提供了保护作用，为使用GSRd 治疗伴糖尿病型牙周炎提供了理论基础。

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