培哚普利对心肌肥厚大鼠心肌组织中肌细胞增强因子2A表达的影响

琚肖肖，赵玉兰，董 静，黄亚萍

郑州大学第二附属医院心内科郑州450014

目前，舒张性心力衰竭的发病率、病死率不断上升，已成为心血管病研究的热点。而心肌肥厚是舒张性心力衰竭的主要病因，是心脏为适应血流动力学超负荷而发生的增生。虽然心肌肥厚早期改变对于维持正常心功能有一定的代偿意义，但它本身也会增加心肌耗氧量，降低心肌顺应性，长期心肌肥厚会导致心力衰竭并增加猝死发生率［1］。心肌肥厚是心肌细胞对多种刺激因素产生的适应性反应，是一个复杂的病理反应过程。肌细胞增强因子2A(myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)是MEF2 家族中的重要一员，在骨骼肌、心肌、平滑肌的分化及血管的发育中起着重要作用［2-3］。该研究旨在通过建立大鼠心肌肥厚模型，观察MEF2A 在正常大鼠、心肌肥厚大鼠、药物干预大鼠心肌组织中的表达情况，了解MEF2A 影响心肌肥厚发生发展的机制及培哚普利对其影响。

1 材料与方法

1．1 实验动物及试剂 健康雄性SPF 级Wistar 大鼠30只，体重300～350 g，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室提供。盐酸异丙肾上腺素(ISO)注射液，2 g/L，上海合丰制药有限公司生产;培哚普利，8 mg/片，施维雅制药有限公司生产。RT-PCR试剂盒(Transgene 公司)，琼脂糖(西班牙生化试剂公司)，PCR 引物(北京博大泰克公司)，SP 试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，MEF2A 抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1．2 动物模型制备 30只Wistar 大鼠应用随机数字表法分为3组，每组10只。①模型组:大鼠皮下注射ISO 3 mg/(kg·d)。②药物干预组:大鼠皮下注射ISO 3 mg/(kg·d)，培哚普利1 mg/(kg·d)溶于2 mL 饮用水中灌胃。③对照组:大鼠皮下注射与ISO 等剂量的生理盐水，灌胃与培哚普利等剂量的生理盐水。各组均连续处理10 d。

1．3 心脏重量参数测定 10 d 后，测量3组大鼠的体重，麻醉后开胸取出心脏，剪去心脏周围的血管及组织，用预冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，然后称全心重量，沿冠状沟剪去左心房，再沿室间沟剪去右室游离壁，称左心室重量，计算全心重量/体重比(HW/BW)、左心室重量/体重比(LVW/BW);将左心室心肌组织分为两部分，一部分放入液氮中储存，另一部分放入40 g/L 多聚甲醛中固定24 h。

1．4 心肌组织的HE 染色 将多聚甲醛固定的心肌组织石蜡包埋，4 μm 厚切片，脱蜡后行常规HE染色，镜下观察各组心肌组织的形态学变化。

1．5 RT-PCR 检测心肌组织中MEF2A mRNA 的表达 以GAPDH 为内参，上游引物5'-CGGCAAGT TCAACGGCACGC-3'，下游引物5'-GCCTGCTTCAC CACCTTCTT-3'，扩增片段大小636 bp;MEF2A 上游引物5'-TTCACTCGTGTCACCGTCTT-3'，下游引物5'-TCTGGTTTCCGACTGTTCAT-3'，扩增片段大小333 bp。提取心肌组织总RNA，按说明书步骤进行逆转录反应。PCR 扩增条件为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环;72℃延伸6 min，55℃退火15 s。取5 μL扩增产物与缓冲液混合后加入琼脂糖凝胶的加样孔中，进行电泳。EB 染色后，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140 图像记录分析系统进行分析，MEF2A mRNA 的相对表达量以MEF2A 和GAPDH条带灰度值的比值表示。

1．6 免疫组化检测心肌组织中MEF2A 蛋白的表达 采用免疫组化SP 法。石蜡切片经脱蜡水化、在PBS 溶液中浸泡、修复抗原、加入多克隆抗体、DAB 染色、苏木素复染等步骤，然后进行分色、洗涤、脱水、透明、封片等，最后用显微镜进行观察，MEF2A 蛋白染色后在心肌细胞中呈棕色颗粒。应用Lecia 图像采集系统，在400 倍视野下进行观察，选取5个染色较均匀区域测量阳性细胞的灰度值，结果取平均值。

1．7 统计学处理 采用SPSS 17．0 进行数据分析。3组间HW/BW、LVW/BW、MEF2A 蛋白及mRNA相对表达量的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 3组大鼠HW/BW 和LVW/BW 的比较 结果见表1。

表1 3组大鼠HW/BW、LVW/BW、MEF2A mRNA 及蛋白相对表达量的比较

2．2 3组大鼠心肌组织的病理学变化 对照组大鼠心肌细胞无明显改变，细胞核居中，心肌细胞排列整齐;模型组可见心肌细胞明显肥大，排列紊乱，间质纤维结缔组织增生明显;药物干预组心肌细胞较模型组稍小，间质纤维结缔组织增生较少。见图1。

图1 3组大鼠心肌组织HE 染色结果(×400)

2．3 3组大鼠心肌组织中MEF2A mRNA 的表达RT-PCR 检测3组大鼠心肌组织中MEF2A mRNA的相对表达量，结果为:模型组＞药物干预组＞对照组。见图2 和表1。

2．4 3组大鼠心肌组织中MEF2A 蛋白的表达MEF2A 蛋白在心肌细胞中表现为棕色颗粒。对照组心肌细胞中可见少量棕色颗粒;模型组中可见大量棕色颗粒;药物干预组中可见部分棕色颗粒，较模型组少。见图3 和表1。

图2 3组大鼠心肌组织中MEF2A mRNA 的表达

图3 3组大鼠心肌组织中MEF2A 蛋白免疫组化染色结果(SP，×400)

3 讨论

心肌肥厚是一种以心脏质量增加为特征的病理生理改变，可继发于多种心血管疾病，最常见的是高血压病。在高血压的初期，心脏后负荷增加导致心脏泵血阻力增加，心脏代偿性肥厚以克服增加的压力负荷，但是持续的压力超负荷引起心肌肥厚失代偿，进而出现猝死、心律失常、心力衰竭等心血管意外［4］。血管紧张素Ⅱ、内皮素以及TGF-β 等因子通过多条通路诱导心肌蛋白合成，使心肌细胞增大，促进心肌肥厚的发生［5-6］。MEF2A 是p38MAPK 信号通路下游的重要调节因子，在信号传导、肌肉组织中结构蛋白的形成中发挥重要的作用［7-8］。该研究通过免疫组化及RT-PCR 的方法分别检测MEF2A 蛋白及mRNA 的表达情况，发现MEF2A 蛋白及mRNA 在模型组的表达均高于对照组，说明MEF2A 可能通过p38MAPK 信号通路介导心肌肥厚的发生发展［9］。

该研究通过比较3组大鼠HW/BW、LVW/BW、MEF2A mRNA 及蛋白相对表达量发现，培哚普利干预后，HW/BW、LVW/BW 及MEF2A mRNA 和蛋白的相对表达量均低于模型组，提示MEF2A 在心肌肥厚的发生发展中起着促进作用，同时说明培哚普利可抑制MEF2A 的表达，进而抑制心肌肥厚的发生。

综上所述，培哚普利可减轻肥厚心肌组织的病理改变，通过调控MEF2A 的表达发挥抑制心肌肥厚的作用。

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