利拉鲁肽对小鼠脂肪细胞脂肪因子、炎症因子及其信号通路的影响*

崔智慧，崔 岩，孙高洁，王 姣，王守俊

郑州大学第一附属医院内分泌科郑州450052

肥胖易引起相关机体紊乱，如胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化、高血压和慢性肾脏病变等，并且增加心血管病的发病率和病死率［1］。研究［2］称约90%的2 型糖尿病患者超重或肥胖。机体肥胖状态时最主要的病理学改变是脂肪组织增生肥大和脂肪细胞功能受损，由此可诱发脂肪细胞炎症反应和胰岛素抵抗。越来越多的研究［3］证实脂肪组织能够生成和分泌大量的细胞因子、生长因子和活性肽等。因此，脂肪组织被认为是一种十分重要的内分泌器官，其所分泌的脂肪因子不仅参与生理状态下糖脂代谢、免疫及心血管功能的维持与调控，而且在肥胖、炎症、代谢综合征和心血管疾病等的发生和发展中扮演着重要的角色［4］。对脂肪因子瘦素、脂联素、CTRP3 和炎症因子TNF-α、IL-6 的研究，为未来糖尿病及肥胖相关性疾病的治疗提供了新的思路［5］。该研究旨在观察新型降糖制剂胰高血糖素样肽-1 类似物利拉鲁肽对小鼠脂肪细胞脂肪因子、炎症因子的影响，探讨利拉鲁肽改善胰岛素抵抗的分子机制及其对炎症信号通路影响的相关机制。

1 材料与方法

1．1 细胞和试剂 小鼠前脂肪细胞株3T3-L1 细胞购自武汉博士德公司。地塞米松(Dex)、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobuthyl-1-methylxanthine，IBMX)购自美国Sigma 公司;Trizol 试剂盒购自Invitrogen 公司;逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific 公司;荧光定量PCR 试剂盒购自Roche 公司;IKK-β 抗体、磷酸化IKK-β(ser181)抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG 均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1．2 细胞的培养及诱导分化成熟 将3T3-L1 前脂肪细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖双抗培养基中，于37℃、体积分数5%CO2条件下培养，待细胞生长至完全融合，48 h 后换用含1 μmol/L Dex、0．5 μmol/L 胰岛素、0．5 mmol/L IBMX的DMEM 高糖培养基诱导分化，3 d 后换用含1 μmol/L Dex、0．5 μmol/L 胰岛素的DMEM 高糖培养基继续培养，每2 d 换液1次，至第10天，约90%的细胞呈脂肪细胞表型时行下一步处理。

1．3 实验分组及处理 将利拉鲁肽溶于培养基中，配成终浓度为10－5mol/L 的溶液。0(对照)、1、10和100 nmol/L 利拉鲁肽处理细胞48 h 后收集细胞备用，100 nmol/L 利拉鲁肽分别处理细胞0、8、24 和48 h 后收集细胞备用，每组均设3个复孔。

1．4 qRT-PCR 检测各因子的表达水平 根据GenBank 中的瘦素、脂联素、CTRP3、TNF-α、IL-6 和内参β-actin 的基因序列设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。使用Trizol 法分别提取上述各组脂肪细胞的总RNA，逆转录成cDNA，然后行qRT-PCR 扩增。反应体系:上、下游引物(1 μmol/L)各4 μL，SYBR Green 10 μL，Rnase-free 水10 μL，cDNA 2 μL。反应条件:95℃预变性10 min;95℃变性10 s，60℃退火/延伸10 s。每次延伸步骤结束后，通过检测反应体系中SYBR Green 与双链DNA 结合后所发出的荧光强度来定量PCR 扩增产物大小。

表1 PCR 引物序列

1．5 IKK-β 及ser181 蛋白表达的检测 收集0、1、10 和100 nmol/L 利拉鲁肽处理48 h 后的细胞，提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，采用Western blot检测IKK-β 及ser181 蛋白的表达。SDS-PAGE 胶上样，电泳、转膜、封闭，一抗稀释1 000 倍后使用，摇床4℃孵育过夜，TBST 洗膜5 min ×3次，加HRP 标记的稀释1 000 倍的二抗孵育1 h，DAB 显色。

1．6 统计学处理 采用SPSS 17．0 进行数据分析，不同浓度利拉鲁肽作用于3T3-L1 脂肪细胞和100 nmol/L 利拉鲁肽作用于3T3-L1 脂肪细胞0、8、24、48 h 对脂肪因子和炎症因子mRNA 表达的影响，以及不同浓度利拉鲁肽对3T3-L1 脂肪细胞IKK-β 及ser181 蛋白表达的影响采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 法，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 不同浓度利拉鲁肽作用于3T3-L1 脂肪细胞48 h 后对脂肪因子、炎症因子mRNA 表达的影响见表2。

表2 不同浓度利拉鲁肽对3T3-L1 脂肪细胞脂肪因子和炎症因子mRNA 表达的影响(n=3)

2．2 100 nmol/L 利拉鲁肽作用于3T3-L1 脂肪细胞不同时间对脂肪因子及炎症因子mRNA 表达的影响 见表3。

表3 100 nmol/L 利拉鲁肽作用不同时间对3T3-L1 脂肪细胞脂肪因子和炎症因子mRNA 表达的影响(n=3)

2．3 不同浓度利拉鲁肽对3T3-L1 脂肪细胞IKKβ、ser181 蛋白表达的影响 0、1、10 和100 nmol/L利拉鲁肽作用于3T3-L1 脂肪细胞48 h 后对IKK-β蛋白的表达水平无影响，而对IKK-β 蛋白的磷酸化有抑制作用，且呈剂量依赖性。见图1。

图1 不同浓度利拉鲁肽对3T3-L1脂肪细胞IKK-β、ser181 蛋白表达的影响

3 讨论

2 型糖尿病患者常伴有肥胖、血脂紊乱、非酒精性脂肪肝等代谢相关性疾病［6］。新型抗糖尿病药物利拉鲁肽不仅具有控制血糖、减轻体重、改善胰岛素抵抗和降低心血管疾病发生风险的作用，还具有潜在的抗炎作用，能够改善肥胖患者的慢性炎症状态。

该研究结果显示利拉鲁肽能够降低3T3-L1 脂肪细胞瘦素、TNF-α、IL-6 mRNA 的表达。瘦素是由肥胖基因所编码的一种分泌型蛋白质，其表达的增加与胰岛素抵抗呈正相关。TNF-α 可对脂肪细胞的生理功能产生多种影响，如活化细胞因子的基因表达、加速胰岛素抵抗的发生等［7］。IL-6 可介导肥胖诱发的慢性炎症和胰岛素抵抗。利拉鲁肽降低3T3-L1 脂肪细胞TNF-α、IL-6 mRNA 表达的结果表明其在体外有抗炎作用。该研究结果亦显示利拉鲁肽能够增加3T3-L1 脂肪细胞脂联素和CTRP3 mRNA 的表达。脂联素在体内的生理作用主要是增加胰岛素的敏感性和促进糖脂代谢［8］，并且通过与其他炎症因子的相互调节控制炎症反应。CTRP3 是近年发现的新型脂肪因子，与脂联素高度同源［9］。相关研究［10］表明，CTRP3 基因敲除的类风湿关节炎小鼠的关节病变更为严重，证实CTRP3 具有抗炎作用。该研究结果表明利拉鲁肽可通过增加抗炎脂肪因子的表达而改善机体的炎症状态。

IKK/Iκ/NF-κ 通路是体内主要的炎症信号通路。IKK-β 可以直接刺激IRS-1 导致丝氨酸抑制性磷酸化，损害胰岛素信号传导［11］，更重要的是IKKβ 激活核转录因子NF-κB，后者激活包括TNF-α 和IL-6 在内的多种细胞因子的基因转录，进一步抑制胰岛素信号传导［12］。因此，IKK-β 信号通路的激活是导致细胞炎症反应和胰岛素抵抗的重要调节因素。该研究中利拉鲁肽在一定的浓度范围内呈剂量依赖性地抑制ser181 蛋白表达，而不改变IKK－β 蛋白的表达，推测利拉鲁肽可能通过降低IKK－β 的磷酸化水平发挥改善机体炎症状态的功能。

综上所述，利拉鲁肽不仅能够减少炎症因子TNF－α、IL－6 的表达，而且能够增加抗炎脂肪因子脂联素、CTRP3 的表达，而这些作用可能通过抑制IKK－β 的磷酸化实现。

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