醋酸钙梯度主动载药法制备芦丁纳米脂质体*

李海霞，杨 耀，路春波，罗 政，张振中

郑州大学药学院郑州450001

芦丁又名芸香苷，是中药槐米的主要成分，亦广泛存在于食物中;作为生物类黄酮(亦称维生素P)，具有不可多得的防病治病作用，如降低毛细血管脆性与通透性、维持血管弹性、防止血细胞凝集、抗氧化、抗炎、抗过敏、抗癌等［1］。临床用于高血压、脑出血、再发性鼻出血、视网膜出血、急性出血性肾炎、出血性紫癜、创伤性肺出血、产后出血等的辅助治疗，也常与维生素C 一起用作营养补充剂。但因其水溶性和脂溶性都很差，导致生物利用度较低，在体内几乎不被吸收，影响了其临床疗效和产品的应用。纳米脂质体具有生物相容性好、可控释放、靶向等优点。将药物制成纳米脂质体，是增加药物溶解度、提高药物生物利用度的一种有效方法。脂质体制剂质量评价中包封率是最重要指标之一，只有药物包封率达80%以上，才满足药典制剂学的要求［2-3］，而酸性化合物，采用醋酸钙梯度主动载药法制备，可大大提高包封率［4］;芦丁为弱酸性黄酮类化合物，是否可采用此法制得高包封率的脂质体，尚未见文献报道。该研究主要以包封率为指标，研究醋酸钙梯度主动载药法制备芦丁纳米脂质体的最佳工艺，并进一步考察所得脂质体的稳定性和体外释放，为改善芦丁溶解度，促进其在体内吸收提供参考。

1 材料与方法

1．1 主要试剂与仪器 芦丁(郑州大学药学院实验室制备，纯度99．9%);大豆卵磷脂(上海爱康精细化工有限公司，批号:120402);胆固醇(成都市科龙化工试剂厂，批号:070511);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30);其他试剂均为分析纯。KQ-3200DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE-52AA 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHZD(Ⅲ)循环水式真空泵和98-2 型加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);截留相对分子质量为8 000～10 000 物质的透析袋(美国Sigma 公司);调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司);JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司);AR1140 型电子天平(美国Ohous 公司);Nano-zs90 型激光纳米粒度分析仪(英国Malvern 公司);Z323 型高速冷冻离心机(德国Hermle 公司)。

1．2 芦丁纳米脂质体的制备 将大豆卵磷脂和胆固醇混合，溶于乙醚与氯仿(体积比为2∶1)的混合溶液中，再逐滴加入120 mmol/L 醋酸钙溶液中，超声得到稳定的单一分散体。35℃减压除尽有机溶剂，凝胶转相为乳悬液时，以醋酸钙溶液定容至10 mL，超声处理，依次以0．45、0．22 μm 滤膜过滤3～4次，即得空白脂质体。室温下缓慢磁力搅拌，以适量30 g/L 蔗糖溶液透析空白脂质体，建立醋酸钙梯度。透析后的空白脂质体，温浴条件下加入一定量用溶解介质溶解的芦丁溶液，孵化即得芦丁纳米脂质体。

1．2．1 醋酸钙梯度建立条件考察 固定大豆卵磷脂浓度为50 g/L，卵磷脂∶胆固醇质量比5∶1，透析时间1 h/次，制备空白脂质体。取5 mL 空白脂质体置透析袋内，以30 g/L 蔗糖为透析介质，室温下缓慢磁力搅拌透析，考察空白脂质体与蔗糖体积比(1∶10、1∶20)及透析次数(3次、4次)对醋酸钙离子梯度建立的影响。用钙指示剂指示终点，采用EDTA 络合滴定法测定蔗糖溶液中钙离子浓度。

1．2．2 卵磷脂与胆固醇质量比 固定大豆卵磷脂浓度50 g/L，芦丁∶卵磷脂质量比(药脂比)为1∶30，孵育温度50℃，孵育时间15 min，考察卵磷脂∶胆固醇质量比分别为2．0 ∶1．0、2．5 ∶1．0、4．0∶1．0、5．0∶1．0、8．0∶1．0、20．0∶1．0 时，芦丁纳米脂质体的包封率。实验重复3次。

1．2．3 药脂比 固定大豆卵磷脂浓度50 g/L，卵磷脂∶胆固醇质量比5∶1，孵育温度50℃，孵育时间15 min，考察药脂比分别为1∶80、1∶40、1∶30、1∶25 和1∶20时，芦丁纳米脂质体的包封率。实验重复3次。

1．2．4 孵育温度 固定大豆卵磷脂浓度50 g/L，卵磷脂∶胆固醇质量比5∶1，孵育时间15 min，药脂比1∶30，考察孵育温度为40、50、60 和70℃时，芦丁纳米脂质体的包封率。实验重复3次。

1．2．5 大豆卵磷脂浓度 固定胆固醇浓度4 g/L，药脂比1∶30，孵育温度50℃，孵育时间15 min，考察大豆卵磷脂浓度分别为20、30、40、50、60 g/L 时，芦丁纳米脂质体的包封率。实验重复3次。

1．2．6 芦丁溶解介质的考察 固定大豆卵磷脂浓度50 g/L，卵磷脂∶胆固醇质量比5∶1，孵育时间15 min，药脂比1∶30，孵育温度50℃，考察芦丁溶解介质为20 g/L SDS、20 g/L PVP、20 g/L β-CD 时，芦丁纳米脂质体的包封率。实验重复3次。

1．3 芦丁的HPLC 法测定

1．3．1 色谱条件［4］ODS C18 色谱柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶冰醋酸(体积比32∶68)，柱温为35℃，流速为1 mL/min，检测波长257 nm，进样量10 μL。

1．3．2 标准曲线绘制 精密称取芦丁对照品1．96 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇，超声溶解，加甲醇至刻度，摇匀即得196 mg/L 的对照品溶液。依次精密量取该液0．25、0．50、1．00、1．50、2．00、2．50 mL，用甲醇稀释至10 mL，制成4．9、9．8、19．6、29．4、39．2、49．0 mg/L 系列浓度溶液，各进样10 μL，以峰面积A 为纵坐标，浓度C 为横坐标，进行线性回归，得回归方程A= 0．242C－0．028 (R2=0．999 5)，线性范围为4．9～49．0 mg/L。

1．3．3 制剂测定 在所用色谱条件下，杂质峰和药物峰分离良好，辅料对药物测定无干扰。芦丁的保留时间约为20 min，理论塔板数不低于3 000。

1．4 芦丁纳米脂质体的质量评价

1．4．1 包封率测定 精密吸取200 μL 芦丁纳米脂质体，用体积分数为10%的Triton X-100 破乳，采用上述HPLC 测定，计算总药量(W总)。另取芦丁纳米脂质体200 μL 至超滤离心管中，12 000 r/min 离心30 min，取下层滤液稀释后进样、检测，计算游离药量(W游)。包封率=(W总－W游)/W总×100%。

1．4．2 粒径与电位 超纯水稀释芦丁纳米脂质体，混合均匀后，25℃条件下，用Nano-zs90 型激光纳米粒度分析仪测定芦丁纳米脂质体的粒径分布和Zeta 电位。1．4．3 稳定性 将脂质体混悬液置于4℃冰箱保存，分别于设定时间点取样，观察脂质体的絮沉现象并测定脂质体的粒径与电位。

1．5 体外释放 精密称取2 mL 芦丁纳米脂质体溶液或含等量芦丁的水溶液，置透析袋中，于30 mL含5 g/L SDS 的pH 7．4 PBS 溶液中透析，条件为:37℃，100 r/min 恒温气浴摇床振荡。在设定时间点取样2 mL，同时补加同温等体积空白新鲜释放介质。以HPLC 测定2 mL 透析液中的芦丁含量，按下式计算脂质体的累积释放率。

累积释放率=(CtV0+∑CiVi)/W×100%。

Ct 和Ci 分别表示t次和第i次取样的浓度，V0和Vi 分别表示释放介质体积和第i次的取样体积，W 为脂质体所含的总药量。

2 结果

2．1 制备工艺

2．1．1 透析条件 测得初始醋酸钙膜外为120 mmol/L，透析3次后降至0．12 mmol/L 以下，因此醋酸钙在脂质体双分子层内外相差已达到1 000 倍以上，而且空白脂质体与30 g/L 蔗糖体积比为1∶10 与1∶20 时测得的钙离子浓度接近，因此透析条件确定为10 倍空白脂质体体积的30 g/L 蔗糖透析3次。

2．1．2 卵磷脂与胆固醇质量比 由表1 可知，随着胆固醇比例的减少，脂质体包封率亦逐步降低，但胆固醇比例过大(卵磷脂∶胆固醇的质量比为2．0∶1．0、2．5∶1．0 和4．0∶1．0)时，脂质体过于黏稠，这与目前公认胆固醇具有调节膜流动性的作用，被称为脂质体“流动性缓冲剂”的观点一致。因此，综合考虑包封率与流动性，选择卵磷脂∶胆固醇质量比为5．0∶1．0。

表1 卵磷脂和胆固醇质量比对包封率的影响

2．1．3 药脂比 如表2 所示，除了药脂比1∶80 外，其他药脂比对包封率影响不大，但在药脂比为1∶25、1∶20 时，随着放置时间增加，易于絮沉，稳定性较差。综合考虑成本和包封率，选择药脂比为1∶30。

表2 药脂比对包封率的影响

2．1．4 孵育温度 如表3 所示，孵育温度增加至50℃时包封率不再增加，当温度超过50℃，包封率甚至呈现递减趋势，这可能因为卵磷脂在高温下易于氧化变质而使包封率降低，因此选择孵育温度为50℃。

表3 孵育温度对包封率的影响

2．1．5 卵磷脂浓度考察 随着卵磷脂用量的增加，包封率随之增加，但卵磷脂超过40 g/L，包封率不仅降低，而且脂质体流动性减弱(表4)。因此，选择的卵磷脂为40 g/L。

表4 卵磷脂浓度对包封率的影响

2．1．6 芦丁溶解介质的考察 由表5 知，用PVP作为芦丁溶解介质时，所得到的脂质体包封率最高，而且β-CD 水溶性差，低温存放易分层，严重影响脂质体的稳定性，因此芦丁溶解介质选择PVP。

表5 不同溶解介质对包封率的影响

2．2 芦丁纳米脂质体的质量评价

2．2．1 包封率 40 g/L 卵磷脂、卵磷脂∶胆固醇质量比5．0∶1．0，药脂比1∶30，20 g/L PVP 增溶的芦丁作为外水相，50℃孵育15 min，包封率达到80．3%。

2．2．2 粒径与电位 芦丁纳米脂质体的平均粒径在185 nm，电位－1．2 mV，多分散指数(PDI)为0．227。

2．2．3 稳定性 按照最佳条件制备的芦丁纳米脂质体样品在28 d 时，仍为乳黄色混悬液，流动性良好，无分层现象;粒径与Zeta 电位均未发生明显变化，样品稳定性良好。

2．2．4 体外释药 不同时间药物累积释放率见图1。芦丁24 h 内仅释放了约23%的药物，而芦丁纳米脂质体24 h 内释放了约80%的药物。

图1 体外释药

3 讨论

虽然芦丁具有良好的防病治病作用，但口服吸收极少，限制了它在临床的应用，发展更好的制剂，已成为克服此类问题的主要研究方向［5-6］。口服用脂质体，因其具有生物膜特性和药物传输能力，具有较强的两亲性，可以提高亲水性药物的渗透性和水不溶性药物的溶解度，最终提高药物的口服跨膜吸收及体内生物利用度［7］。

评价脂质体制剂质量，包封率是一项非常重要的指标，因此《中国药典》2010年版明确规定脂质体制剂包封率不得小于80%［3］。包封率低也是脂质体工业化的最大障碍之一［2］。醋酸钙梯度主动载药法可明显提高酸性药物的包封率，原因如下:空白脂质体在逐步透析后，内水相醋酸钙中的醋酸根离子水合为醋酸，醋酸的跨膜速度远远大于钙离子(为钙的107倍)［8］，大量醋酸快速跨过脂质双分子膜进入外水相，留在内水相中的OH－与弱酸性药物所在的外水相形成了一定的pH 值梯度，成为制备弱酸性药物的高效驱动力，使原本外水相中的药物主动进入内水相，从而大大提高包封率。该实验考察结果显示，醋酸钙梯度主动载药法在最佳条件下制备的芦丁纳米脂质体包封率达到80．3%，符合药典要求，可申报药物新剂型。而采用传统薄膜分散法制备的芦丁纳米脂质体，包封率仅为66．5%［9］，不能成为药物。

在pH 梯度载药的过程中，外水相中分子态的弱酸性药物越多，越易跨膜内转进入内水相，而使包封率增加。但芦丁在水中的溶解度仅为0．19 g/L［10］，为增加外水相中分子态芦丁浓度，该实验使用了溶解介质增溶，结果表明PVP 可很好地提高包封率。

制剂的物理稳定性与其粒径、PDI、Zeta 电位等密切相关，实验制备的芦丁纳米脂质体已达纳米级，而且PDI 较小，提示此脂质体较稳定。文献［5］报道原料芦丁在3．5 h 的体外累计溶出为16%，说明原料芦丁在体外释放度较低。经制成纳米脂质体后，其释放度大大增加，提示此脂质体如在体内使用，可能会增加体内吸收，从而有效提高芦丁的生物利用度。

综上所述，作者制成符合药典规定的芦丁纳米脂质体，与芦丁片相比，有望提高其生物利用度。

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