N-甲基环丙沙星酰腙的合成及抗肿瘤活性*

尚慧杰，高留州，谢玉锁，闫 强，吴书敏，倪礼礼，黄文龙，谢松强，胡国强#

1)郑州澍青医学高等专科学校药学系 郑州450064 2)河南大学化学生物学研究所 开封475001 3)中国药科大学新药研究中心南京210009

基于拓扑异构酶不但是抗肿瘤药物的重要作用靶酶［1］，也是抗菌氟喹诺酮羧酸的作用靶酶，且两种拓扑异构酶在功能和序列上具有相似性［2］，因此，通过结构修饰可转化抗菌氟喹诺酮羧酸的抗菌活性到抗肿瘤活性［3］。但是，目前对氟喹诺酮的结构修饰多集中于喹啉环C-7 杂环取代基的变化，所产生的候选物因机体内毒性或稳定性或生物利用度等生物学问题而未能进入临床评价［4］。因此，通过新的结构修饰途径降低氟喹诺酮的毒性、增加其稳定性、提高其生物利用度是促进其抗肿瘤候选化合物向成药性发展的关键环节。研究［5］发现，氟喹诺酮C-3 位羧基虽是抗菌活性所必需的药效团，但并非为抗肿瘤活性所必要，可被其生物电子等排体稠杂环替代，但这样将导致化合物的刚性较强、相对分子质量过大，不利于成药性的发展［6］。酰腙化合物因具有N，O 供电子原子，易与大分子靶标形成氢键而增加其亲合力，从而提高其抗肿瘤活性;另一方面，酰腙中的亚胺N=C 双键也较活泼，易与靶标大分子中的亲核基团如氨基(NH2)和巯基(SH)进行加成，进一步提高其细胞毒性［7］。鉴于上述研究成果，作者选择重要的药效团酰腙作为抗菌氟喹诺酮N-甲基环丙沙星C-3 羧基的生物电子等排体，设计合成了新的目标化合物N-甲基环丙沙星酰腙，并进行了体外抗肿瘤活性评价，以期发现抗肿瘤氟喹诺酮苗头化合物，为进一步优化提供指导。

1 材料与方法

1．1 合成路线 目标化合物4a～4l 的制备见线路图1。环丙沙星(化合物1)经甲基化反应得到N-甲基环丙沙星(化合物2)［8］，然后发生肼解反应得到N-甲基环丙沙星酰肼(化合物3)。酰肼与苯甲醛或取代的苯甲醛通过缩合反应得到N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4a～4l)。

图1 目标化合物4a～4l 的制备路线图

1．2 主要材料与仪器 环丙沙星(化合物1)为商业品，N-甲基环丙沙星由(化合物2)由化合物1 通过Eschweiler-Clarke 甲基化反应制备，其余试剂为分析纯。实验用癌细胞株购自中国科学院细胞库。WK-1B 数字熔点仪(上海精密科学仪器厂);Bruker AM-400 型核磁共振仪(德瑞士Bruker 公司)，DMSO-d6 为溶剂，TMS 为内标;Esquire LC 型质谱仪(德国Bruker 公司);PE2400-Ⅱ型元素分析仪(美国PE 公司);BIO-RAD-680 型酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1．3 化学合成 将化合物2(72．5 g，0．21 mol)和80%水合肼(105 g，2．1 mol)的混合物加热搅拌回流反应8 h;冷却至室温，滤集固体，用无水乙醇重结晶，得黄色结晶(化合物3)。取1．0 g (2．8 mmol)化合物3 溶于15 mL 无水乙醇中，加入等物质的量的苯甲醛或取代苯甲醛，回流10 h;放置室温，过滤析出的固体，乙醇洗涤。用无水乙醇或DMF-乙醇重结晶，得黄色固体目标化合物4a～4l。

1．4 抗肿瘤活性实验 取目标化合物4a～4l、对照蒽醌类抗肿瘤药阿霉素(DOX)及母体环丙沙星用DMSO 配成1．0 ×10－2mol/L 的储备液，用RPMI 1640 稀释到所需浓度(0．1、1．0、10．0、50．0、100．0 μmol/L)，制备供试液。①取对数生长期的人肝癌细胞(SMMC-7721)，以每孔5 000个细胞接种于96孔板。隔夜培养后，加入供试液。48 h 后弃去培养基，每孔加入1 g/L MTT 溶液100 μL，继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，轻轻振荡30 min，用酶标仪在570 nm 波长处测OD 值。②取对数生长期的小鼠白血病细胞(L1210)和人白血病细胞(HL60)，以每孔7 000个细胞接种于96 孔板，随后加入供试液。48 h 后每孔加入5 g/L MTT 溶液10 μL，继续培养4 h 后加入10 g/L SDS 溶液100μL 培养过夜，用酶标仪在570 nm 波长处测OD 值。细胞生长抑制率=(1 －实验组OD/对照组OD)×100%。以药物浓度对数值对抑制率作线性回归，得剂量-效应方程，依此计算出供试化合物对癌细胞的半数抑制浓度(IC50)。所有实验在相同条件下重复进行3次。

2 结果

2．1 化合物的结构表征 N-甲基环丙沙星酰肼(化合物3):收率70%;mp 222～224℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．16 (s，1H，CONH)，8．75 (s，1H，2-H)，7．82 (d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．56 (d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，4．57(s，2H，NH2)，3．75～3．67(m，1H，1＇-H)，3．56 (t，J =6．2 Hz，4H，2 ×2＇-H)，2．67(t，J =6．2 Hz，4H，2 ×3＇＇-H)，2．24 (s，3H，CH3)，1．25～1．12(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):360 ［M + H］+;Anal．calcd．for C18H22FN5O2:C 60．15%，H 6．17%，N 19．49%;Found:C 60．36%，H 6．38%，N 19．74%。

苯甲醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4a):收率86%;mp 243～245℃;1H NMR (DMSO-d6)δ:13．13(s，1H，CONH)，8．73(s，1H，2-H)，8．44(s，1H，N=CH)，7．92(d，J=13．2 Hz，1H，5-H)，7．78～7．46(m，6H，8-H 和Ph-H)，3．81～3．78(m，1H，1＇-H)，3．28(t，J=6．2 Hz，4H，2 ×2＇-H)，2．65(t，J =6．2 Hz，4H，2×3＇-H)，2．26(s，3H，CH3)，1．27～1．16(m，4H，2×2＇-H);EI-MS(m/z):448［M+H］+;Anal．calcd．for C25H26FN5O2:C 67．10%，H 5．86%，N 15．65%;Found:C 67．34%，H 5．56%，N 15．87%。

水杨醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4b):收率82%;mp 218～220℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．18(s，1H，CONH)，11．32(s，1H，OH)，8．73(s，1H，2-H)，8．32(s，1H，N = CH)，7．86(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．53(d，J=7．2 Hz，1H，8-H)，7．36～6．68(m，4H，Ph-H)，3．82～3．80(m，1H，1＇-H)，3．35～3．28(m，4H，2 ×2＇-H)，2．57(br，4H，2 ×3＇-H)，2．25(s，3H，CH3)，1．23～1．17(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):464 ［M + H］+;Anal．calcd．for C25H26FN5O3:C 64．78%，H 5．65%，N 15．11%;Found:C 65．02%，H 5．37%，N 15．34%。

小茴香醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4c):收率72%;mp 152～154℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．17(s，1H，CONH)，8．67(s，1H，2-H)，8．28(s，1H，N = CH)，7．87(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．56(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．38～6．72(m，4H，Ph-H)，3．87(s，3H，OCH3)，3．82～3．76(m，1H，1＇-H)，3．34～3．25(m，4H，2 ×2＇-H)，2．58(br，4H，2 ×3＇-H)，2．26(s，3H，CH3)，1．24～1．26(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):478 ［M + H］+;Anal．calcd．for C26H28FN5O3:C 65．40%，H 5．91%，N 14．67%;Found:C 65．62%，H 5．78%，N 14．83%。

大茴香醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4d):收率86%;mp 166～168℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．15(s，1H，CONH)，8．68(s，1H，2-H)，8．26(s，1H，N = CH)，7．84(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．57(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．43～6．68(m，4H，Ph-H)，3．88(s，3H，OCH3)，3．83～3．75(m，1H，1＇-H)，3．32～3．24(m，4H，2 ×2＇-H)，2．63(br，4H，2 ×3＇-H)，2．25(s，3H，CH3)，1．27～1．22(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):478 ［M + H］+;Anal．calcd．for C26H28FN5O3:C 65．40%，H 5．91%，N 14．67%;Found:C 65．66%，H 5．74%，N 14．85%。

胡椒醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4e):收率93%;mp 251～253℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．14(s，1H，CONH)，8．69(s，1H，2-H)，8．35(s，1H，N = CH)，7．86(d，J = 13．2 Hz，1H，5-H)，7．53～7．02(m，4H，8-H and Ph-H)，6．12(s，2H，OCH2O)，3．81～3．77(m，1H，1＇-H)，3．36～3．28(m，4H，2 ×2＇-H)，2．57～2．52(m，4H，2 ×3＇-H)，2．26(s，3H，CH3)，1．27～1．20(m，4H，2 ×2＇-H);EIMS(m/z):492 ［M + H］+;Anal．calcd．for C26H26FN5O4:C 63．53%，H 5．33%，N 14．25%;Found:C 63．70%，H 5．09%，N 14．51%。

香草醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4f):收率87%;mp 219～221℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．21(s，1H，CONH)，10．87(s，1H，OH)，8．87(s，1H，2-H)，8．28(s，1H，N = CH)，8．04(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．60～6．85(m，4H，8-H and Ph-H)，3．87(s，3H，CH3O)，3．83～3．80(m，1H，1＇-H)，3．35～3．26(m，4H，2 ×2＇-H)，2．58～2．53(m，4H，2 ×3＇-H)，2．28(s，3H，CH3)，1．26～1．20(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):494［M +H］+;Anal．calcd．for C26H28FN5O4:C 63．28%，H 5．72%，N 14．19%;Found:C 63．56%，H 5．57%，N 14．38%。

3，4，5-三甲氧苯甲醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4 g):收率75%;mp 179～181℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．15(s，1H，CONH)，8．82(s，1H，2-H)，8．37(s，1H，N=CH)，7．96(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．82(d，J=7．2 Hz，1H，8-H)，7．46(s，2H，Ph-H)，3．86，3．88(2s，9H，3 ×CH3O)，3．81～3．76(m，1H，1＇-H)，3．34～3．18(m，4H，2 ×2＇＇-H)，2．56～2．53(m，4H，2 ×3＇-H)，2．26(s，3H，CH3)，1．18～1．24(m，4H，2 × 2＇-H);EI-MS(m/z):538 ［M +H］+;Anal．calcd．for C28H32FN5O5:C 62．56%，H 6．00%，N 13．03%;Found:C 62．74%)，H 5．87%，N 13．26%。

4-氟-苯甲醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4h);收率86%;mp 213～215℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．17(s，1H，CONH)，8．86(s，1H，2-H)，8．38(s，1H，N = CH)，8．03(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．96(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．83(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．68(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．80～3．78(m，1H，1＇-H)，3．38～3．22(m，4H，2 ×2＇-H)，2．67～2．58(m，4H，2 ×3＇-H)，2．30(s，3H，CH3)，1．23～1．25(m，4H，2 × 2＇-H);EI-MS(m/z):466［M+ H］+;Anal．calcd．for C25H25F2N5O2:C 64．51%，H 5．41%，N 15．04%;Found:C 64．68%，H 5．28%，N 15．24%。

4-氯-苯甲醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4i):收率74%;mp 157～159℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．13(s，1H，CONH)，8．82(s，1H，2-H)，8．35(s，1H，N = CH)，8．02(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，7．87(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．81(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．66(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．76～3．72(m，1H，1＇-H)，3．36～3．20(m，4H，2 ×2＇-H)，2．63～2．56(m，4H，2 ×3＇-H)，2．28(s，3H，CH3)，1．21～1．24(m，4H，2 × 2＇-H);EI-MS(m/z):482［M+ H］+;Anal．calcd．for C25H25ClFN5O2:C 62．30%，H 5．23%，N 14．53%;Found:C 62．48%，H 5．46%，N 14．71%。

4-硝基-苯甲醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4j):收率92%，mp ＞260℃;1H NMR(DMSO-d6)δ:13．21(s，1H，CONH)，8．86(s，1H，2-H)，8．47(s，1H，N =CH)，8．12(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，8．04(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．86(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．73(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．78～3．81(m，1H，1＇-H)，3．37～3．25(m，4H，2 × 2＇＇-H)，2．66～2．63(m，4H，2 ×3＇-H)，2．31(s，3H，CH3)，1．23～1．25(m，4H，2 × 2＇-H);EI-MS(m/z):493［M+H］+;Anal．calcd．for C25H25FN6O4:C60．97%，H 5．12%，N 17．06%;Found:C 61．13%，H 5．35%，N 17．24%。

4-羧基-苯甲醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4k):收率85%;mp 252～254℃;1H NMR(DMSOd6)δ:15．47 (brs，1H，COOH)，13．25 (s，1H，CONH)，8．94(s，1H，2-H)，8．56(s，1H，N = CH)，8．18(d，J=13．2 Hz，1H，5-H)，8．07(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．88(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．75(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．86～3．79(m，1H，1＇-H)，3．38～3．27(m，4H，2 ×2＇-H)，2．74～2．65(m，4H，2 ×3＇-H)，2．33(s，3H，CH3)，1．28～1．25(m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS(m/z):492［M +H］+;Anal．calcd．for C26H26FN6O4:C 63．53%，H 5．33%，N 14．25%;Found:C 63．74%，H 5．18%，N 14．57%。

4-磺酰胺基-苯甲醛缩N-甲基环丙沙星酰腙(化合物4l):收率81%;mp ＞260℃;1H NMR(DMSOd6)δ:13．25(s，1H，CONH)，8．92(s，1H，2-H)，8．48(s，1H，N = CH)，8．12(d，J =13．2 Hz，1H，5-H)，8．06(d，J=7．5 Hz，2H，Ph-H)，7．87(d，J =7．2 Hz，1H，8-H)，7．73(s，2H，H2N)，7．66(d，J =7．5 Hz，2H，Ph-H)，3．76～3．71(m，1H，1＇-H)，3．40～3．31(m，4H，2 ×2＇-H)，2．78～2．67(m，4H，2 ×3＇-H)，2．35(s，3H，CH3)，1．19～1．32)，m，4H，2 ×2＇-H);EI-MS (m/z):527 ［M + H］+;Anal．calcd．for C25H27FN6O4S:C 57．02%，H 5．17%，N 15．96%;Found:C 57．25%，H 5．36%，N 16．18%。

2．2 体外抗肿瘤筛选结果 见表1。

表1 化合物4a～4l 对SMMC-7721、L1210 和HL60 细胞的IC50(n=3) μmol/L

3 讨论

环丙沙星与甲酸和甲醛通过Eschweiler-Clarke反应在C-7 哌嗪基进行甲基化，制得N-甲基环丙沙星，接着与水合肼发生肼解反应得N-甲基环丙沙星酰肼，进一步与芳香醛缩合得目标化合物酰腙。

该研究结果表明，12个酰腙目标化合物对3种肿瘤细胞的抑制活性(IC50＜50．0 μmol/L)虽然低于DOX，但均显著强于母体环丙沙星;对肝癌细胞(SMMC-7721)的抑制活性高于对白血病细胞(L1210 和HL60)，显示出了一定的选择性。初步的构-效关系表明，当苯环含有吸电子取代基如羧基或磺酰胺基时，其抗肿瘤活性强于其他取代基化合物的活性，其IC50已达到μmol/L，这可能是吸电子基团能够活化酰腙亚胺双键，有利于与作用靶发生亲核加成而产生细胞毒作用;同时，除带有酚羟基外，随着苯环取代基体积的增大，活性降低。由此可初步知道，由抗菌氟喹诺酮发展抗肿瘤氟喹诺酮时，没有必要保留C-3 羧基，可用等排体酰腙替代，这为进一步的结构修饰提供了重要的依据和方法。

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