两种方式注射白消安对SD大鼠生精功能的影响*

李学银，张卫星，张天标，李 锐，王朝亮，王 瑞#

1)郑州大学第一附属医院泌尿外科 郑州450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室;郑州大学肿瘤分子外科研究所郑州450052

白消安又称马利兰，为氮芥类烷化剂，临床上常用于慢性粒细胞性白血病的化疗。既往文献［1-2］报道中有以腹腔注射40 mg/kg 白消安建立大小鼠唯支持细胞综合征模型的先例，但是作者在前期实验中发现此剂量引起实验组34只SD 大鼠全部死亡，死亡时间为注射后7～12 d。虽然Ogawa 等［3］曾指出大鼠对白消安毒害作用更为敏感，白消安也更多地用于制备小鼠生精功能障碍模型和唯支持细胞综合征模型，但大鼠用于此类动物模型制作具有许多不可替代的优势如:大鼠生命力强，能耐受多种有创操作;大鼠睾丸较大，方便行病理学检查，且为后续研究中注射骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)提供方便;大鼠的精子发生过程与人类更接近［4］;既往文献对大鼠BMSCs 的研究更成熟、深入，因此该实验选择SD 大鼠作为实验对象。在结合相关文献［5-6］的基础上，作者观察了分别经腹腔分次注射及睾丸内注射不同剂量白消安对SD 大鼠生精功能的影响，探讨以其建立SD 大鼠生精功能障碍模型的可行性，为最终建立稳定可靠的SD 大鼠唯支持细胞综合征模型打下基础，报道如下。

1 材料与方法

1．1 实验动物与主要试剂 140只6～8 周雄性SD大鼠［许可证号:SCXK(鲁)2013-0001］，体重250～280 g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，饲料及垫料由河南省实验动物中心提供，于河南省医药科学研究院动物中心饲养并进行实验。白消安(大连美仑生物技术有限公司，纯度＞98．5%)，二甲基亚砜(DMSO，郑州莱宝生物科技有限公司，纯度＞99．9%)，水合氯醛(普通市售，配制质量浓度为100 g/L)。腹腔注射组白消安溶液的制备:每8 mg 白消安溶于1 mL DMSO 中，加入1 mL 双蒸水，混匀;睾丸内注射组白消安溶液的制备:以移液管分别取DMSO 和双蒸水各0．025 mL 置于EP 管中，将白消安先溶于DMSO 再溶于双蒸水，最终白消安质量浓度为0．50～2．24 g/L。现用现配，注射时将混合液置于37℃水浴箱中以防白消安析出。

1．2 经腹腔分次注射白消安溶液 70只SD 大鼠采用随机数字表法分为7组，每组10只。A1、B1、C1、D1组(实验组)分别注射剂量为40、30、20 和15 mg/kg 的白消安溶液，每只注射0．9～2．8 mL，E1组(溶剂对照组)注射DMSO 溶液2 mL，F1组(阴性对照组)注射双蒸水2 mL，G1组(空白对照组)不处理。注射方法:以上剂量分为5次隔天注射入大鼠腹腔。

1．3 睾丸内注射白消安溶液 70只SD 大鼠采用随机数字表法分为7组，每组10只，均注射左睾丸，A2、B2、C2、D2组注射剂量分别为0．1、0．2、0．3 和0．4 mg/kg 的白消安溶液，E2组注射DMSO 溶液(溶剂对照组)，F2组注射双蒸水(阴性对照组)，G2组(空白对照组)不处理。将大鼠仰卧位固定于大鼠固定板，以3 mL/kg 剂量水合氯醛腹腔注射麻醉后以吉尔碘消毒左侧睾丸局部皮肤，以1 mL 注射器抽取溶液并注射至大鼠左侧睾丸(由于睾丸体积较小，故统一注射0．05 mL)，进针约达睾丸横径1/3 时开始推液，边注射边进针，约至睾丸横径2/3 时推完溶液。

1．4 血常规检测 将大鼠麻醉后以心脏采血法取血1～2 mL，采用日立7150 全自动血液分析仪自动检测各组红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)。由于腹腔注射组不断有大鼠死亡，所以在观察到大鼠有明显濒死表现时即麻醉并取血和双侧睾丸;睾丸内注射组观察30 d 后取血和双侧睾丸。

1．5 睾丸病理检查 所取大鼠睾丸标本均以40 g/L 甲醛溶液固定、包埋、切片，并行HE 染色，使用德国Leica 显微镜观察摄片。采用Salman 等［7］提出的改良Johnson 评分法评分。

1．6 统计学处理 采用SPSS 17．0 处理数据，各组间RBC、HGB 及睾丸病理评分的比较采用单因素方差分析和LSD-t 检验，不符合方差齐性的数据(PLT)采用Wilcoxon 秩和检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 生存状况 腹腔注射实验中各实验组大鼠全部死亡，A1组死亡时间为完全注射白消安后0～2 d，B1组为4～6 d，C1组为12～21 d，D1组为9～16 d，死亡前均表现为虹膜变为灰白色、眼睑结痂、活动迟缓等，另有部分表现有鼻周、肛周血迹，尾部皮肤破损等，各对照组均生长良好，无类似表现。睾丸内注射组均生长良好。

2．2 血常规检查 由于部分大鼠突然死亡或取血时发生血凝，腹腔注射实验中4 实验组只获得15 份血常规结果，分别为A1组3 份，B1组3 份，C1组5份，D1组4 份。腹腔注射实验各组大鼠血常规值见表1。睾丸内注射实验各组大鼠血常规结果见表2。2．3 睾丸病理 HE 染色结果见图1，2 实验各组大鼠睾丸组织Johnsen 评分结果见表3、4。

表1 腹腔注射实验各组大鼠血常规检测结果

表2 睾丸内注射实验各组大鼠血常规检测结果

图1 腹腔注射实验和睾丸内注射实验中各组大鼠睾丸病理表现(HE，×400)

表3 腹腔注射实验各组大鼠睾丸病理评分

表4 睾丸内注射实验各组大鼠睾丸病理评分

3 讨论

近年来，重度少弱精症及无精症患者呈增加的趋势。科研上向睾丸移植BMSCs［8-9］已成为研究热点，并且已有证据［10-11］证明鼠类BMSCs 能分化为睾丸生精细胞和间质细胞或者说是生精细胞样和间质细胞样细胞。白消安成分明确，对于大鼠的毒性主要为抑制骨髓造血干细胞。既往报道［2-3］用白消安制作大鼠生精功能障碍模型的剂量与致死率高低不一，40 mg/kg 剂量单次腹腔注射致死率在12．5%～100．0%。结合周雪原等［5］的经验，考虑到连续10次腹腔注射对大鼠损伤较大、操作复杂，该研究腹腔注射白消安中实验组采用隔天、连续5次注射15～40 mg/kg 的白消安溶液，结果0～21 d 内各实验组大鼠仍全部死亡，血RBC、HGB 和PLT 较空白对照组降低;此外，可能由于死亡时间较早，各剂量组睾丸病理评分较空白对照组无明显改变。

为探寻建立一种更为简便、稳定的生精功能障碍实验动物模型的方法，作者亦尝试了睾丸内注射白消安溶液。考虑到大鼠睾丸与体重比值约为1∶100，且睾丸内注射使得药物直接浸润作用于睾丸，故剂量设定为0．1、0．2、0．3 和0．4 mg/kg，结果显示给药组大鼠均生长良好，无一死亡，血RBC、HGB 和PLT 值较空白对照组无明显变化，睾丸病理评分较空白对照组降低，但各组精原细胞及精母细胞均存在，说明4种剂量的白消安均可造成大鼠睾丸生精功能障碍，但尚不足以制作BMSCs 移植所需的唯支持细胞综合征模型。结合王琛［6］的经验:6 mg/kg 剂量可以建立小鼠唯支持细胞综合征模型，可以推测存在合适的较大的剂量制备大鼠唯支持细胞综合征模型。由于睾丸内注射吸收面积远较腹腔注射小，并且即使加大剂量，白消安进入血液的量也远较腹腔注射吸收少，因此并不会明显增加对大鼠的毒害，可以在一个较大的剂量区域找出合适的剂量制备大鼠唯支持细胞综合征模型。

综上所述，经腹腔注射白消安对大鼠毒害性很大，分5次隔天注射15～40 mg/kg 剂量白消安仍会导致大鼠30 d 内死亡;0．1～0．4 mg/kg 剂量白消安睾丸内注射均能引起大鼠生精功能障碍，是一种新的、值得深入研究的方法。

［1］Lue Y，Erkkila K，Liu PY，et al．Fate of bone marrow stem cells transplanted into the testis:potential implication for men with testicular failure［J］．Am J Pathol，2007，170(3):899

［2］张德迎．骨髓间充质干细胞移植重建大鼠生殖功能的实验研究［D］．重庆:重庆医科大学，2008．

［3］Ogawa T，Dobrinski I，Brinster RL．Recipient preparation is critical for spermatogonial transplantation in the rat［J］．Tissue Cell，1999，31(5):461

［4］Meistrich ML．Hormonal stimulation of the recovery of spermatogenesis following chemo-or radiotherapy［J］．APMIS，1998，106(1):37

［5］周雪原，任宇，马玉珍，等．白消安致大鼠无精子症模型的建立［J］．现代生物医学进展，2012，12(32):6234

［6］王琛．一种新型白消安制备精原干细胞移植受体方法对小鼠生殖及生理功能的影响［D］．南宁:广西大学，2013．

［7］Salman FT，Adkins ES，Fonkalsrud EW．Morphologic effects of unilateral cryptorchidism on the contralateral descended testis［J］．J Pediatr Surg，1988，23(5):439

［8］Cakici C，Buyrukcu B，Duruksu G，et al．Recovery of fertility in azoospermia rats after injection of adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells:the sperm generation［J］．Biomed Res Int，2013，2013:529589

［9］Bhartiya D．Are mesenchymal cells indeed pluripotent stem cells or just stromal cells?OCT-4 and VSELs biology has led to better understanding［J］．Stem Cells Int，2013，2013:547501

［10］Nayernia K，Lee JH，Drusenheimer N，et al．Derivation of male germ cells from bone marrow stem cells［J］．Lab Invest，2006，86(7):654

［11］Yazawa T，Mizutani T，Yamada K．et al．Differentiation of adult stem cells derived from bone marrow stroma into Leydig or adrenocortical cells［J］．Endocrinology，2006，147(9):4104