拟缺香茶菜提取物体外对3种肿瘤细胞增殖的抑制作用*

陈慧平，马 方，邹 敏，李继成，张 艳，赵志鸿，王桂芳，张壮丽，张小俊

郑州大学医药科学研究院药化研究室郑州450052

拟缺香茶菜别名野紫苏，为唇形科香茶属植物，在我国分布范围相当广泛，可供药用者达30 余种，是民间广泛使用的草药，大都具有清热解毒、活血化瘀、抗菌消炎及抗肿瘤等功效［1］。香茶菜属植物含有多种次生代谢产物，其中对映贝壳杉烷型二萜化合物是其最主要的次生代谢物［2］。据报道［3］，该类化合物具有良好的生物活性，如细胞毒活性、抗氧化作用、免疫调节作用及抗菌抗病毒作用。为了更好地开发利用该植物资源，寻找其活性成分，该研究采用MTT 法观察拟缺香茶菜乙醚和乙酸乙酯提取物对人肝癌细胞株HepG2、人食管癌细胞株EC9706和人乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1 增殖的抑制作用，为进一步分离其抗肿瘤活性成分提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 药材 拟缺香茶菜采自河南龙浴湾，经郑州大学药学院李继成教授鉴定。将采集的拟缺香茶菜地上部分自然阴干，磨碎，装入塑料袋密封，置于干燥阴凉处备用。

1．1．2 主要试剂 MTT、RPMI 1640 培养基(美国Solarbio 公司)，优质胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，其余试剂均为市售分析纯。

1．1．3 主要仪器 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号RE-2000)，CO2培养箱(力康发展有限公司，型号HF160W)，倒置显微镜(奥林巴斯，型号BDS200)，EXL800uv 全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司，型号168-1000XC)，生物安全柜(力康发展有限公司，型号HFsafe-1200TE)，精密可调微量移液器(德国Eppendorf 公司)。

1．1．4 细胞 HepG2、EC9706、TPC-1 细胞均由郑州大学医药科学研究院药化研究室提供。

1．2 药材的提取、分离 取拟缺香茶菜原药材1 kg，粉碎机粉碎，用无水乙醚5 000 mL 浸泡21 d(乙醚需淹没药材)，用滤纸常温、常压下过滤，减压浓缩得浸膏(乙醚提取物)29 g。将乙醚提取后的残渣倒入干净的搪瓷盘，常温下乙醚挥发完全，直到无乙醚味;把残渣装入一5 L 球形烧瓶中，加入3 500 mL乙酸乙酯，浸泡24 h，加热回流2 h，然后常温、常压下过滤，得到约2 800 mL 浸取液，减压浓缩得浸膏(乙酸乙酯提取物)22 g。

1．3 MTT 法测定不同溶媒提取物对各肿瘤细胞的增殖抑制作用

1．3．1 细胞培养 HepG2、EC9706 和TPC-1 细胞均为贴壁细胞，使用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基在37℃、饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱中常规培养;每2～3 d 换液1次，当细胞达90%融合时进行传代培养。实验过程中用台盼蓝染色法检测细胞活性。

1．3．2 提取物的处理 分别准确称取拟缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物，加入二甲基亚砜充分溶解后配成100 g/L 母液，置于－20℃冰箱避光保存。临用前用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基稀释成所需浓度。

1．3．3 MTT 检测方法 收集对数生长期细胞，用细胞计数板计数，调整细胞悬液密度为(7～8)×104mL－1，于96 孔细胞培养板中每孔加入100 μL，每个浓度设3个复孔，体积分数5% CO2、37℃孵育24 h，待细胞贴壁后小心吸去上清，加入含0．80、4．00、20．00、100．00、500．00 mg/L(HepG2 和TPC-1 细胞)或3．12、6．25、12．50、25．00、50．00 mg/L(EC9706 细胞)拟缺香茶菜提取物的培养基100 μL，并设空白对照孔。连续培养48 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)，继续培养4 h 后，小心吸去孔内培养基，每孔加入二甲基亚砜150 μL，置摇床上低速避光振荡6 min，使结晶物充分溶解，酶标仪(检测波长490 nm，参考波长630 nm)测定，并读取各孔吸光度(A)值，按下面公式计算肿瘤细胞的增殖抑制率:增殖抑制率=(1 －给药孔A 值/空白对照孔A 值)×100%，同时计算2种提取物对3种肿瘤细胞的半数有效抑制浓度(IC50)［4］。

1．4 统计学处理 采用SPSS 21．0 进行统计学处理。5组间细胞增殖抑制率的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验;2种提取物IC50的比较采用两独立样本的t 检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 拟缺香茶菜提取物对体外培养的肿瘤细胞增殖的抑制作用 结果见表1、2。

表1 HepG2 和TPC-1 细胞增殖抑制率的比较(n=3) %

2．2 拟缺香茶菜提取物体外抗肿瘤作用的比较 2种提取物对3种肿瘤细胞的IC50见表3。

表2 EC9706 细胞增殖抑制率的比较(n=3) %

3 讨论

当前肿瘤的化学预防研究的主要目标之一是寻找高效、低毒的药物。随着分子肿瘤学研究的深入，抗肿瘤天然药物研发过程中体外抗肿瘤实验已成为必不可少的一部分［5］。MTT 法具有灵敏度高、重复性好、操作简便、经济等特点，常用于抗肿瘤药的体外初筛试验［6］。

作者选用拟缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物进行了体外细胞增殖检测，结果表明乙醚提取物和乙酸乙酯提取物对HepG2、EC9706 和TPC-1 细胞均有较强的增殖抑制作用。研究［7］表明，使用MTT 法进行抗癌药物体外筛选时，植物粗提物IC50＜20 mg/L 时，则判断样品对体外肿瘤细胞具有强杀伤作用。在该研究中拟缺香茶菜乙醚提取物对EC9706 细胞的IC50为(2．36 ±0．15)mg/L，乙酸乙酯提取物对该细胞的IC50为(4．15 ±0．18)mg/L，提示拟缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物对EC9706 细胞均有较强的杀伤作用。

总之，拟缺香茶菜乙醚提取物对HepG2、EC9706 和TPC-1 细胞均有较好的增殖抑制作用，尤其是对EC9706 细胞的增殖抑制作用更强，但其具体活性成分、活性成分抗瘤谱及体内抗肿瘤活性等方面还有待进一步深入研究。

［1］李火云，焦珂，张鹏，等．拟缺香茶菜化学成分研究［J］．中草药，2014，45(2):154

［2］李恒，普建新，李捷．唇形科香茶菜属二萜类化合物分布规律［J］．植物分类与资源学报，2013，35(1):81

［3］吴月霞，张伟，李继成，等．尾叶香茶菜化学成分的研究［J］．中草药，2011，42(12):2402

［4］赵斌，葛金芳，朱娟娟，等．小议在MTT 法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法［J］．安徽医药，2007，11(9):834

［5］周全，陈建伟，刘晓蓉，等．柳树中生物碱类化合物抗肿瘤活性的体外实验研究［J］．南京中医药大学学报，2012，28(3):238

［6］游文玮，赵培亮，邹敏，等．新结构嘧啶类化合物的合成及抗肿瘤活性筛选［J］．南方医科大学学报，2011，31(5):875

［7］Wu YX，Zhang W，Li JC，et al．Chemical constituents of flowers and fruits of Rabdosia excisa［J］．Chin J Nat Med，2012，10(1):43