胃癌转导信号调控网络在胃癌发生发展中的相关性研究

唐明武 陈文习

胃癌转导信号调控网络在胃癌发生发展中的相关性研究

唐明武 陈文习

目的筛选胃癌发生发展过程中的差异表达基因，构建差异调控网络。方法在本文的研究中，我们从公共基因表达数据库（GEO数据库）中下载胃癌相关表达谱数据GSE2685的基因芯片（7个正常组织样本，23个胃癌组织样本），筛选胃癌和正常胃组织的差异基因（P＜0.05及差异值＞2或＜-2）；计算差异基因与靶基因间的皮尔森相关系数（∣PCC∣＞0.75），构建差异调控网络；GO富集方法分析差异调控网络基因的功能。结果在这个调控网络中，一些转录因子（TFs）和靶基因在之前的相关研究中已经被证实与胃癌相关。此外我们也发现一些新的转录因子和靶基因与胃癌相关。有效的整合以往的研究结果，让我们对应用转录调控网络识别胃癌相关基因的方法有了新的认识。结论基于转录调控网络的方法识别胃癌相关基因具有很好的应用价值。

胃癌；转录因子；转录调控网络

全球每年新发胃癌100余万，中国占42%，死亡约80万，中国占35%，是胃癌发病率和死亡率最高的国家之一。在消化系统恶性肿瘤死亡病例中，约半数死于胃癌。早期胃癌经足够的治疗后，90%以上患者能生存5年以上或治愈，而晚期胃癌患者，治疗后5年生存率不足5%[1]。因此，早发现是改善疗效、提高生存率的关键[2]。研究表明，细胞信号转导的异常与细胞的分化、凋亡、扩增密切关，也与肿瘤等多种疾病的发生、发展和预后有着直接的关系[3]。近来基于蛋白质互作网络的研究，已揭示了肿瘤状态与正常状态间局部的信号调控差别[4]。细胞功能可通过调节基因的表达，对外界的刺激做出反应[5]，可显著提高肿瘤转移的识别效能[6-7]。为了从系统角度理解癌症的信号调控模式，本文综合多种信息，构建人类信号网络，分析其网络拓扑属性。对这些转录因子及通路上新进展的理解，有助于我们对胃癌的创新性复合型方法的研发铺平道路。在本研究中，我们试图应用转录调控网络筛选几种潜在的和胃癌相关的基因，并探索几种新的具有预测性的生物标志物和靶基因。

材料和方法

一、数据来源

1.Affymetrix基因芯片数据

从公共功能基因组学数据库GEO（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[8]中下载一个胃癌转录谱的基因芯片，编号为GSE2685[9]。此数据集包含7个正常组织的样本，23个胃癌组织的样本。基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）是基于美国昂飞公司平台数据建立的一个公用数据库平台。平台信息：GPL80（Affymetrix人类基因组U133 2.0芯片）。芯片的探针注释信息来自A ffymetrix公司，包含所有A ffymetrix ATH1（25K）芯片的探针信息。下载原始文件以及该平台探针注释信息文件。

2.通路数据

KEGG（京都基因和基因组百科全书）是一个与基因组，酶通路和生化制品相关的在线的数据库集合（Kanehisa，2002），其中PHTHWAY数据库中收录了细胞内分子间相互作用的网络和和它们在特定组织中的突变体（http://www.genome.jp/kegg/）。从KEGG数据库中总共收集了130个通路，包含2 287条基因。

3.基因本体论（GeneOntology,GO）

数据：通过收集和整理生物学过程对应的GO功能注释以及对应的基因，最终得到11 726个生物学过程的GO功能注释，在这些生物学过程中共涉及了21 553个基因。

4.调控数据

转录因子和靶基因调控关系数据，来自TRED和TRANSTAC数据库。从TRANSFAC数据库中收集到219个转录因子和265个靶基因之间的774对调控关系。从TRED数据库中收集到102个转录因子和2 920个的靶基因之间的5 722对调控关系。将两组数据集进行整合，得到276个转录因子和3 002个靶基因间的6 328对调控关系。

二、方法

1.数据预处理及差异基因分析

利用稳健多序列平均法（Robust Multiarray Averaging,RMA）对芯片数据进行预处理，删除那些对应多个基因的探针和没有对应基因的探针，对于有多个探针的基因，取均值。用R语言的limma包对胃癌相对于正常样本进行差异表达值计算，并用贝叶斯方法进行多重检验校正。选取P值＜0.05及差异值＞2或＜-2作为显著性阈值，得到差异表达基因。

2.差异调控网络构建

为了构建胃癌差异调控网络，将得到的差异表达基因与从TRED和TRANSTAC数据库收集到的调控数据进行匹配。通过计算差异表达转录因子和靶基因之间的皮尔森相关系数（PCC）来构建调控网络。若PCC＞0.75或PCC＜-0.75，则保留该转录因子与其靶基因的调控关系，最后用Cytoscape软件进行调控网络绘制。

3.GO富集分析

用DAVID在线分析软件对差异调控网络中的基因进行功能富集分析。

结果

一、胃癌差异表达基因的筛选

基于t检验对基因表达数据中的胃癌样本和正常对照样本进行差异表达分析，P值利用FDR进行多重检验校正。基于显著性水平FDR=0.01，mRNA表达谱的差异表达分析识别了2 966个异常的基因。这些差异表达基因可能与胃癌的发生，发展密切相关。具有最显著差异表达的前10个基因见表1 。

表1 最显著差异表达的前10个基因

二、胃癌差异调控网络构建

通过计算胃癌差异基因与靶基因间的皮尔森相关系数，得到了介于9个转录因子和82个靶基因中有87对调控关系。在图中，转录因子MYC和FLI1在该调控网络中处于核心位置，和另外4个转录因子以及73个靶基因存在调控关系，在这个调控网络中，JUN，SMAD2，ETS2，XBP1具有更核心的位置，这些事实表明，这些基因可能在胃癌的发生中起着重要作用。见图1。

图1 胃癌差异调控网络构建

三、差异调控网络的GO功能富集

为了阐明转录水平的基因表达调控机制，分别对胃癌与正常组织中差异调控网络进行了GO功能富集分析。对调控网络中基因进行功能富集分析，多个GO条目被富集，包括对胞内细胞信号通路，细胞程序性死亡，细胞死亡，对刺激物的反应，对细胞外刺激因子的反应，生物发生的正调节作用等等。表2 是胃癌差异调控网络的GO富集结果（显著富集的前15项，其中FDR值越小，富集性越显著）。

表2 差异调控网络的GO功能富集

讨论

对胃癌中相关调节网络的构建结果分析可知，许多转录因子和通路与胃癌紧密相关。我们构建的转录调控网络中的JUN，Fli-1，ETS2，XBP1和其它的一些调控基因与胃癌的发生密切相关，这些发现也经之前相关研究证实。

JUN是公认的禽类肉瘤病毒17的变体基因。这个基因编码一个与病毒蛋白具有高度相似性的蛋白，编码的蛋白与特定的靶向基因序列相互作用来调节基因的表达。当正常的细胞转染M iRNA（m iR）-146后，c-Jun的表达量明显下调，c-Jun在免疫和炎症反应中起着负调节作用，并且在胃癌中具有高表达[9]。

Fli-1，是一个ETS家族的核酸结合转录因子成员，它参与细胞的增殖和肿瘤的形成。Fli1敲出的老鼠由于失去了血管的完整性而导致大脑出血，易死于胚胎发育过程中，表明Fli1参与血管的重构过程中起关键作用基因的调控[10]。

MYC转录因子家族有3个成员，分别是NMYC基因、L-MYC基因和C-MYC基因。这三种基因都编码一种细胞核内的，与细胞周期调控有关的DNA结合蛋白。相关报道显示用核酸杂交和免疫组化方法检测了胃癌中c-myc基因的扩增和表达，初步阐明了c-myc基因结构异常与胃癌发生的关系[11]。国外Ureshino等[12]用小鼠模型证实了MYC基因在胃癌的发生和发展中的作用。E2F1是E2F转录因子家族中的一个成员。E2F1参与细胞周期调控，同时也诱导细胞凋亡[13]。研究发现E2F1过表达可以导致大鼠胚胎成纤维细胞转变成肿瘤细胞，这表明E2F1作为一个癌基因发挥作用[14]；然而也有研究发现，当对E2F1进行功能缺失时，肿瘤的发生率明显升高，表明E2F1对肿瘤又存在抑制的作用[15]。TP53参与细胞周期的调控，DNA的修复和细胞凋亡。研究已经证实TP53蛋白在人类许多肿瘤，如乳腺癌、结肠癌等中都有高表达[16]。ESR1基因编码一类配体激活的转录因子雌激素受体ERα。ERα被发现在人和小鼠的前列腺组织中有表达，并且参与调控上皮组织生长[17]。Kameda等的研究表明，ERα的表达能够增加患胃癌的风险。然而，对于雌激素受体对于患胃癌的风险的影响，仍然存在争议[18]。

本文研究发现了多个与胃癌发生与进展相关的基因，包括MYC、E2F1、TP53、ESR1等。对差异基因的研究有助于进一步了解胃癌发生及转移的分子机制，并为胃癌的诊断和治疗提供新的标志物和靶标。

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Study of transcriptional regulatory network on the progress of human gastric cancer

TANGMing-wu, CHENWen-xi.
DepartmentofGastroenterology,Central Hospitalof Ezhou,HubeiProvince 436000

Objective The purposeof thisstudywas to construct transcriptional regulatory networksusing differentially expressed genes in gastric cancer screened by DNA microarray.Methods We downloaded the gene expression profile of gastric cancer from Gene Expression Omnibus database GSE2685 which included 7 normal tissuesand 23 gastric cancer tissues.Then,we identified the differentially expressed genes(DEGs) between gastric cancer and normal sam ple tissuew ith the threshold of P＜0.05 and fold change value＞2 or＜-2.We calculated the Pearson Correlation Coefficient(PCC)between DEGs and their targetgenes to construct regulatory networksw ith the cutoff criterion of∣PCC∣＞0.75.GO enrichmentmethod wasused to analyze the function of genes in regulatory networks.Results In this regulatory network,some transcription factorsand targetgeneshad been confirmed in the previous related research associatedw ith gastric cancer.In addition,we also found some new transcription factorsand targetgenesassociated with gastric cancer.An effective integration of previous research results broughtus confidence on the application of transcriptional regulatory network for identifying gastric cancer associated genes.Conclusion We identified the thatDEGswere associated w ith progression of gastric cancer.The findingsm ightprovide the ground work for the further study of themolecularmechanism of gastric cancer.

Gastric cancer;Transcriptional factors;Transcriptional regulatory network

2014-07-08）

（本文编辑：白杨）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.01.002

436000湖北省鄂州中心医院消化内科

陈文习，E-mail：964494093@qq.com