南海南部海域异养浮游细菌生长对外源营养物的响应*

侯 瑞，白 洁，刘小沙，高会旺，赵阳国

（中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100）

海洋异养细菌是海洋物质循环和能量流动中的重要组成部分［1］，是海洋生态系统有机质的分解者以及重要的二次生产者［2］，在海洋中数量大、繁殖速度快、转换效率高，生物量循环迅速，在海洋生态环境中占有重要地位［3］。海洋异养细菌生长也是海洋碳、氮、磷等元素的生物化学过程的重要环节［4－6］，其中异养细菌的生产会消耗海水中的溶解性有机碳DOC和营养盐（无机氮DIN、磷酸盐P）并转换为自身的生物量，而细菌的呼吸会代谢自身产物并转化为CO2，它们之间的关系会决定异养细菌的转换效率，进而影响细菌的生长［7］。因此，海水和营养盐等营养物质是影响异养细菌生长的重要限制因子［8－9］。

南海是中国面积最大的海域，属于贫营养海区，其表层水温终年较高（25℃以上）［10］，叶绿素和初级生产力水平较低［11］。由于受海水营养的限制，南海异养浮游细菌出现数量较少、分布不均［12－14］。南海属于陆间海，面临着大气沉降、近岸陆源输入和船舶排放等外来营养源的影响［15］，这势必对海洋异养细菌种群数量、群落结构和功能产生一定的影响［9，16］。然而，对于南海异养浮游细菌与营养盐关系的研究主要集中于南海北部上升流区域和珠江口及大陆架海区，发现南海北部上升流区域和珠江口区域异养细菌主要受磷限制，而大陆架海区异养细菌主要受DOC限制［12－13］，对南海南部异养浮游细菌的研究还要追溯到1986［17］和2009年［18］，主要是对异养细菌分布的研究。南海南部海域的环境条件与南海北部类似，但是其还受不同内部物理过程和外部河流输入的影响［19］，所以进行外源营养物对南海南部海域异养细菌生长代谢影响的研究具有着重要意义。

本研究于2012年8月利用现场观测和模拟培养相结合的方法对南海南部两个典型站位海水中异养浮游细菌生长的影响因素进行了研究。通过单独和联合投加DOC和N、P等营养要素，观察异养细菌生物量、细菌比生长速率和呼吸速率的响应，研究南海贫营养盐区域异养细菌生长的限制因子，探讨外源营养物对细菌物质转换效率和异养细菌生态功能的影响。

1 材料与方法

1.1 现场观测、培养与样品采集

在南海南部海域选取两个有代表性的海盆区域站位S1站（112°39.140′E，6°36.052′N）和陆架区域S2站（111°16.647′E，10°29.709′N）进行现场观测和模拟培养（见图1）。由船载自容式CTD（Seabird 25，USA）采集表层1m处海水，同时测定现场水温、盐度、pH和溶解氧（DO）。水样采集后，部分样品置于已加入多聚甲醛的10mL无菌螺口管中，用于细菌生物量的测定；部分水样过滤后用于营养盐、DOC测定；部分水样立即用65μm的筛绢过滤以除去浮游动物的摄食干扰，分装于1.5L的无菌PET瓶中，装满水并加入外源营养物质后用半透膜封口，防止外界干扰但可保持瓶内外交换。将培养瓶置于甲板，在通过循环海水的恒温条件下培养6d。

培养实验共设5组：1个对照组和4个营养物添加组，其中C组为对照组、D组只添加DOC、DN组添加DOC和N、DP组添加DOC和P、DNP组同时添加DOC、N和P，每组均设3个平行。添加的DOC为葡萄糖、N为KNO3、P为KH2PO4，实验分组和添加营养物质的摩尔质量见表1。分别在第0、1、2、3和第6天中午定时取各培养组的水样用于细菌和环境因子的测定，同时测定培养瓶中的温度、盐度、pH和DO。每次均取平行样。

图1 南海采样站位Fig.1 Sampling stations of South China Sea

表1 实验分组及营养物质添加量Table 1 Ambient nutrient concentration /μmol·L－1

1.2 现场环境因子及营养盐和DOC的测定

现场水温、盐度和pH等数据由CTD测得，溶解氧（DO）由WTW 500i便携水质分析仪测得。

DOC样品用高温燃烧氧化法由岛津TOC-V型总有机碳测定仪测定［20］。

营养盐测定使用BRAN＋LUEBBE AA3型营养盐自动分析仪进行。N-N用次氯酸钠氧化靛酚蓝法［20］，N-N用铜—镉柱还原后盐酸萘乙二胺络合显色法，N-N用盐酸萘乙二胺络合显色法［21］。

1.3 细菌活性的测定

1.3.1 细菌生物量 将细菌样品过滤到0.22μm的核孔膜上，经过DAPI染色后，用Leica全自动荧光显微镜对异养细菌进行计数［23］。用换算因子20fg C/cell将异养细菌丰度换算为以碳单位表示的细菌的生物量［1］。

1.3.2 细菌比生长速率 根据公式p＝（lnN2－lnN1）/T计算培养3d前后细菌比生长速率，其中N1和N2是培养时间T前后的细菌总数［24］。

1.3.3 细菌呼吸速率 参照Vazquez-Dom在2007年的方法，根据每一时段前后DO浓度的变化量并换算成C消耗量来计算1d前后和3d前后细菌的呼吸速率［25］。

1.4 数据统计

采用SPSS17.0统计软件进行多因素方差分析（Multivariate Analysis of Variance），计算显著差异性，其中sig.＜0.05代表结果在不同分组上的差异具备显著性。

应用SPSS17.0的Correlate程序计算分析不同指标类型结果之间的相关性。

2 结果与讨论

2.1 不同站位的环境特征分析

本研究所在的S1站位于南海南部南沙群岛南部区域，属于贫营养程度大的海盆区域，受人为影响较小；S2站位于南海西南部近岸陆架区域，靠近湄公河河口区，附近航线比较集中，受人为影响较大。2个站位表层海水的水温、盐度、pH、营养盐现场监测结果见表1，可以看出2个站位均具有南海典型的高水温、高盐度、高pH、寡营养盐特征，其DOC、DIN和磷酸盐水平大致与Yuan在2011年在南海北部得到的数值（DOC 70μmol/L，DIN 4μmol/L，P0.1μmol/L）相近［12］。因为S2站靠近湄公河河口区，盐度和营养盐稍低于S1站，而DOC则高于S1站。S1的N∶P比值为15.87，S2的N∶P比值为17.57，S1站的N∶P比值与Redfield比值接近［26］，S2站的N∶P比值高于S1站。S1站和S2站表层水体的异养细菌丰度分别为1.45×105和2.15×105cell/mL，均低于Yuan在南海北部贫营养盐区域测得的表层海水异养细菌丰度值（6±1）×105cells/mL的结果［12］，说明南海南部异养细菌生长受到环境因子的限制高于北部海区。

2.2 异养细菌生物量及对外源营养物的响应

2个站位表层海水异养细菌的生物量见图2。在S1站，培养期间对照组细菌生物量一直呈现缓慢下降的趋势；而只添加DOC的D组，细菌生物量在培养1d内即达到最大值0.090 5mg C/L，是培养前的3.12倍；在培养2d后开始迅速下降。同时添加DOC和N或DOC和P的DN组和DP组的细菌生物量增长较D组缓慢，1d后开始迅速增长，在培养2d后分别达到最大值0.086 7和0.098 8mg C/L，分别为对照组的3.22和3.68倍。同时添加DOC、N和P的DNP组细菌生物量上升较其他组缓慢，在2d开始迅速增长，在3d达到最大值0.166 0mg/L，是对照组的8.89倍。在培养结束时的第6天，S1站DOC添加的D组异养细菌生物量较对照组有明显增长（P＜0.05），DN组、DP组异养浮游细菌生物量大于D组但不明显（P＞0.05），而DNP组细菌生物量则明显大于D组（P＜0.05）；3种营养物联合联合添加使细菌生物量显著增加的结果表明，在南海南部贫营养的S1站，细菌的生长除受DOC的限制外，受DOC、N和P等环境因子的联合限制更为明显。

在离岸相对较近的S2站，各实验组异养细菌生物量的变化规律与S1站有所不同，各组生物量均在1d后快速增长，并在2d后达到最大值，D组、DN组、DP组、DNP组分别为0.085 8、0.170 8、0.237 6、和0.185 4 mg/L，分别为对照组的1.29 倍、2.56倍、3.56倍和2.78倍。其中，DP组细菌生物量的最大值。S2站各组细菌生物量均在培养第3d后开始逐渐降低。添加DOC的D组异养细菌生物量与对照组的差异不显著（P＞0.05），说明DOC对S2站异养细菌生长的限制不明显；添加P组的生物量较对照组的显著增大（P＜0.05），表明离岸较近的S2站细菌生物量受P的限制更为明显。

表2 不同站位的现场环境因子及细菌测定结果Table 2 Initial environmental factor of the stations

图2 不同营养物添加组细菌生物量的变化Fig.2 Variation of bacterial biomass among different treatments

2.3 异养细菌呼吸速率及对外源营养物的响应

在培养期间的前3天内，S1站和S2站不同组异养细菌呼吸速率的变化结果见图3。在远海的S1站，培养期间对照组细菌呼吸速率呈现缓慢下降的趋势；添加DOC的D组细菌呼吸速率在1d即有明显升高并达到最高值，为1.035mg/L·d；DN、DP和DNP组的细菌呼吸速率则在培养期间一直呈现出上升趋势，在第3天分别为对照组的3.44、3.02和4.01倍。

S2站的细菌呼吸速率与其细菌生物量的变化趋势比较相似，其中DOC、DN组均在2d达到最大值，分别为0.818和1.155mg/L·d，为对照组的1.28倍和1.81倍，之后稍有下降。而DP组和DNP组的细菌呼吸速率在培养第3d达到最大值，分别为1.288和1.241mg/L·d，是对照组的2.01倍和3.06倍。

随着营养物质的增加，异养细菌的生长需要更多的能量进行物质合成，所以异养细菌的呼吸作用出现了增大的态势［26］。在S1站，DOC对异养细菌呼吸速率的促进作用较为明显（P＜0.05），并且在添加DOC的基础上，联合添加N、P对异养细菌呼吸速率的作促进用更为显著（P＜0.05）；氮的添加对细菌呼吸速率的促进效果比磷的添加更为显著（P＜0.05），同样表明该海域细菌生长以DOC限制为主，同时可能受氮的限制。

在离岸相对较近的S2站，营养物质添加对细菌呼吸速率的增加与S1有所不同，添加DOC组细菌呼吸效率的增长对照组差异不显著（P＞0.05），联合添加磷的DP组对细菌呼吸速率的促进效果最为显著（P＜0.05），进一步表明该海域细菌活性受磷的限制更为明显。

图3 不同营养物添加组细菌呼吸速率的变化Fig.3 Variation of bacterial respiration rate among different treatments

2.4 异养细菌比生长速率及对外源营养物的响应

不同组异养细菌在培养前3天的比生长速率见表3。在S1站，对照组在培养前3天异养细菌比生长速率为负值，说明不添加外源营养物质，由于营养缺乏会导致异养细菌数量在培养期间缓慢下降。而添加DOC的D组细菌比生长速率明显大于对照组（P＜0.05），表明异养细菌数量的增长受到了DOC的限制；Yuan等在2011年和Kirchman等在2000年也得出海洋异养细菌在近岸海域主要受DOC限制的结论［5，12］；DN组、DP组和DNP组的细菌比生长速率明显大于D组（P＜0.05），且DN组的比生长速率明显大于DP组（P＜0.05），而DNP组的细菌比生长速率最大，主要因为当环境中DOC限制缓解后，氮和磷会成为细菌生长的限制因子［29］，表明在S1站异养细菌的生长主要受DOC的限制，同时也存在氮的限制。

在S2站，D组前3天的比生长速率比对照组大但不显著（P＞0.05），这与S2站环境中的DOC浓度较高有关。DN、DP和DNP组的比生长速率明显高于对照组（P＜0.05），其中DP组细菌比生长速率较对照组的增长最为明显，进一步说明在S2站异养浮游细菌生长受磷的限制更为明显。而DP组的细菌比生长速率大于DNP组；这可能是因为在S2站异养细菌是磷限制且浮游植物是氮限制的，同时加氮和磷会可能促进浮游植物的生长并使其与异养细菌竞争其它营养物质，一定程度上抑制了浮游细菌的生长［27］。

2.5 细菌生长效率及对外源营养物的响应

Pradeep-Ram在2002年曾报道，海水中细菌的呼吸速率与细菌生产之间有着紧密的关系［24］。异养细菌的比生长速率与细菌呼吸速率的比值可作为细菌物质转换效率的指标。通过对2个站位培养期间前3d的异养细菌比生长速率和呼吸速率进行相关性分析，可见二者之间存在着显著的正相关关系（r＝0.896，P＜0.01）。2个站位比生长速率与细菌呼吸速率的比值见表3；比值越大，说明细菌对物质的转换效率越高，细菌异养程度越高［28］。在不同实验组中，2个站位联合添加DOC、氮和磷3种营养物质对于细菌转换效率的促进作用最为明显；此外，在S1站氮的添加对细菌转换效率的促进作大于磷，而在S2站则相反。

外源营养物质在促使异养细菌生物量和呼吸速率增长的同时，使异养细菌的异养程度进一步增大，也增加了细菌的物质转换效率，将有助于其在南海南部海域生态效率的提高。

表3 培养3d时异养细菌比生长速率（p）、呼吸速率（r）及二者比值的（p/r）Table 3 Bacterial special growth rate and bacterial respiration rate

3 结论

（1）南海南部2个站位S1、S2都属贫营养状态，其异养细菌生物量相对于其他海域较低。在海盆区的S1站，异养细菌生长的主要限制因子是DOC，其次是氮限制；而在近岸的S2站，异养细菌则主要受磷限制。

（2）当南海南部海域2个站位海水受外源营养物输入时，异养细菌生物量和呼吸速率叫对照组明显增高。在S1站，同时添加DOC、氮和磷时异养细菌生物量、比生长速率和呼吸速率的增加最为显著；而近岸的S2站，同时添加DOC和磷时异养细菌生物量、比生长速率和呼吸速率增长最为显著。外源营养物质的添加使2个站位异养细菌的异养程度明显增加，将异养细菌的物质转换效率明显增加，显著提高其在南海南部海域的生态作用效率和生态功能。

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