染色姜黄中金胺O的检测方法研究

翟清??杨志伟??石鑫磊??范纯玲

[摘要] 目的 建立姜黄用工业染料金胺O非法染色的检查方法。 方法 采用TLC法、HPLC-PAD法、HPLC-MS法，对多批次姜黄样品进行定性定量分析。 结果 经检测30批市售样品中，有18批检出金胺，其质量浓度在0.12～0.86mg/g。 结论 姜黄染色所用化工原料为金胺O，本研究所建立的检测方法，可以满足定性定量的要求。

[关键词] 姜黄；金胺O；TLC；HPLC-MS法

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）17-57-04

Detection method of staining in turmeric auramine O

ZHAI Qing YANG Zhiwei SHI Xinlei FAN Chunling

Songyuan Institute for Food and Drug Control of Jilin Province， Songyuan 138000， China

[Abstract] Objective Establishment of turmeric with industrial dye staining auramine O illegal screening method. Methods The technique of TLC， HPLC-PAD and HPLC-MS were developed for qualitation and quantitative analysis mutiple batches of samples turmeric. Results After testing 30 batches of commercial samples， six batches detected in auramine， its content in the 0.12～0.86mg/g. Conclusion Turmeric staining with chemical raw materials for auramine O， detection method established in this paper， to meet with qualitative and quantitative requirements.

[Key words] Turmeric； Auramine O； TLC； HPLC-MS

姜黄收载于《中国药典》2010年版一部，为姜科植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎。具有破血行气，通经止痛的功效，用于胸胁刺痛，胸痹心痛，痛经经闭，癥瘕，风湿肩臂疼痛，跌扑肿痛[1]。为中医临床较常用中药，也是多种中成药的原料药。由于中药材市场经营还比较混乱，掺杂使假现象比较严重，经过市场调查发现，姜黄除用片姜黄冒充外[2-3]，有一部分可能由于保存时间过长或保存温度过高，出现表面颜色变浅现象，个别中药经营人员为了追求经济利益，用化工原料金胺O进行非法染色。姜黄具有抗癌作用[4]，金胺O对人体有较大的危害，具有致癌作用[5]，不应出现在中药中[6]。近年来，中药材、中药饮片常用报道非法使用金胺O染色[7-13]。本研究通过TLC法，HPLC-PAD法、HPLC-MS法，鉴定证明姜黄所用染料为金胺O，并建立了检查方法，实验结果如下。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Waters2695-2988，PAD检测器，Empower 2色谱工作站。Agilent1200-6410B液相色谱-质谱联用系统，ChemStation色谱工作站。

1.2 试药

金胺O对照试剂购自中国食品药品检定研究院，批号111770-201011，姜黄对照药材购自中国食品药品检定研究院，批号121188-200502。姜黄药材、饮片购自吉林省各地区的市售样品。薄层色谱板为硅胶G薄层色谱板，购自青岛海洋化工厂分厂；水为超纯水，经检验合格，乙腈为色谱纯，其余乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、氨水、磷酸二氢钾、磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

取本品粉末3g，加25mL 70%乙醇，密封，超声处理30min，过滤，滤液作为供试品溶液。另取金胺O对照试剂10mg，置100mL量瓶中，加70%乙醇适量使溶解，再加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。再取姜黄对照药材3g，加25mL 70%乙醇，密封，超声处理30min，过滤，滤液作为供试品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，取供试品溶液和对照药材溶液各10μL、对照试剂溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（4：5：1：1）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，立即检视。供试品色谱中，在与对照试剂色谱相应的位置上，若显相同颜色的斑点，说明样品中含有金胺O染色。若不显示相同颜色的斑点，说明样品中不含金胺O染色。对照药材色谱中，在与对照试剂色谱相应的位置上，不显相同颜色的斑点。

1 2 3

1.姜黄对照药材溶液；2.对照试剂溶液；3.含金胺O姜黄样品溶液

图1 姜黄样品TLC图

2.2 金胺O的HPLC-PAD法确认

2.2.1 色谱条件 色谱柱为phenomenex Luna C18（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-0.05mol/L醋酸铵（35：65）为流动相；采用二极管阵列检测器，检测波长为432nm。理论塔板数按金胺O对照试剂色谱中的主峰计算，应不低于3000。

2.2.2 对照试剂溶液的制备 对照试剂溶液的制备取金胺O对照试剂10mg，置200mL量瓶中，加70%乙醇适量使溶解，再加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取上述薄层鉴别项下的供试品溶液，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取姜黄对照药材3g，加70%乙醇25mL，密塞，超声处理30min，滤过，即得。

2.2.5 测定法 吸取供试品溶液与对照试剂溶液及阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.2.6 专属性试验 为了证明该方法具有专属性，将对照试剂溶液，含金胺O样品、阴性样品（对照药材）溶液，分别进样，进行液相色谱的考察，结果薄层色谱含有金胺O的样品溶液呈现与金胺O对照试剂保留时间相同的色谱峰；比较320～450nm波长范围的紫外一可见吸收光谱，吸收光谱相同。阴性样品（对照药材）溶液未检出与金胺O对照试剂相同的色谱峰。从而证明该补充检验方法和检验项目具有专属性。见图2～3。

1

2

3

1.对照试剂溶液；2.含金胺0供试品溶液；3.阴性（对照药材）溶液

图2 金胺O对照试剂、含金胺O样品、阴性液相色谱图

1

2

3

1.对照试剂溶液；2.含金胺0供试品溶液；3.阴性（对照药材）溶液

图3 金胺O对照试剂、含金胺O样品、阴性紫外-可见吸收光谱图

2.3 金胺O的HPLC-MS法进一步确认

2.3.1 色谱条件 色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Phenomenex Gemini C18色谱柱，以乙腈-0.05mol/L醋酸铵（35：65）为流动相，流速为0.6mL/min，检测波长为432nm。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）正离子检测，二级质谱全扫描模式，母离子m/z268.1，子离子扫描范围m/z20～300，；干燥气温度350℃，干燥气流速10L/min；源电压4kV；裂解电压170V；雾化气压力241kPa；碰撞能量30eV。

2.3.3 测定法 取上述HPLC-PAD法测定用的对照试剂溶液及含有金胺O的样品溶液10μL，注入Agilent1200-6410B液相色谱-质谱联用系统测定，进行二级质谱全扫描（MS/MS）分析。

2.3.4 结果 两者出现相同的选择离子流色谱峰，因此证实姜黄染色物为金胺O。二级质谱图见图4。

2.4 HPLC检查方法的建立与验证

2.4.1 线性范围考察 精密称取金胺O对照试剂适量，加70%乙醇制成5.12、10.23、20.46、40.92、81.84μg/mL的溶液，分别精密吸取10μL进样测定，以对照品进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，计算回归方程Y=7063532.8024X+1203.2070（r=1.0000），结果表明金胺O在0.0512～0.8184μg范围内线性关系良好。

A金胺O对照试剂溶液；B含金胺0供试品溶液

图4 金胺O对照试剂、含金胺O样品二级质谱图

2.4.2 精密度试验 取一份供试品溶液，在色谱条件下不变的情况下，连续进样6次，每次10μL，测定色谱峰面积，计算RSD=0.1%。

2.4.3 稳定性试验 取一份供试品溶液，在色谱条件不变的情况下，每隔4h进样1次，重复进样6次，每次10μL，测定色谱峰面积，RSD=0.1%，结果表明24h内供试品溶液中金胺O基本稳定。

2.4.4 重现性试验 取同一供试品6份，分别按供试品溶液制备的方法制成供试品溶液，取对照试剂溶液及上述供试品溶液分别进样，结果6份样品均检出金胺O。确定所采用的检查方法具有重现性。

2.4.5 耐用性 通过用同一供试品溶液的3支色谱柱进样，证明了采用的方法在实验条件有所改变时，该方法仍然适用。

2.4.6 回收率 精密称取已知质量浓度的供试品粉末（金胺O质量浓度为0.7mg/g）6份，每份约1g，分别精密加入金胺O对照试剂溶液（0.1021mg/mL）7.0mL，依法测定，计算回收率。测得金胺O的平均回收率为98.97%，RSD=0.5%。结果见表1。

2.4.7 样品测定 取市售姜黄样品30批，按上述方法测定金胺O质量浓度，结果有18批含有金胺O，质量浓度在0.12～0.86mg/g。结果见表2。

3 讨论

金胺O，又称盐基淡黄、金丝雀黄、奥黄、碱性槐黄等，为化工色素，被国际癌症研究所（IARC）列为人类致癌化合物。主要用于醋纤、棉织品的染色，和纸张、皮革、油漆等的着色。人接触可引起中毒，对皮肤黏膜有轻度刺激，可引起结膜炎、皮炎和上呼吸道刺激症状，长期食用，体内残留物将对人体肾脏、肝脏造成损害，甚至致癌，因此不应用于中药染色。

姜黄主要含挥发油、姜黄素等成分，按照《中国药典》一部要求应该置阴凉干燥处储存，但销售使用单位一般均未按要求储存，加上姜黄使用量不多，经过长时间储存可能使挥发油挥发，致使有效成分质量浓度不够。姜黄素也叫姜黄色素，本身实际上也常用于染色，但长时间暴露在空气中，有效成分质量浓度会有所降低，也出现颜色变浅现象，一些药商为了追求经济利益，对其进行金胺O染色，而且不论姜黄药材还是姜黄饮片，均有染色现象。在制备供试品溶液时，对甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇分别进行了考察，结果根

表1 金胺O回收率试验结果

NO 取样量（g） 样品质量浓度（mg） 加标量（mg） 测得量（mg） 回收率（%）

1

2

3

4

5

6 1.0184

1.0101

0.9788

1.0406

1.0148

1.0026 0.7129

0.7071

0.6852

0.7284

0.7104

0.7018 0.7147

0.7147

0.7147

0.7147

0.7147

0.7147 1.4167

1.4159

1.3899

1.4362

1.4228

1.4083 98.47

99.17

98.60

99.03

99.68

98.85

表2 54批市售样品测定结果

序号 品名 样品来源 规格 TLC结果 HPLC-PAD结果 HPLC-MS结果 金胺O质量浓度（mg/g）

1 姜黄 安徽亳州 饮片 检出 检出 检出 0.14

2 姜黄 山东济南 药材 未检出 未检出 未检出 /

3 姜黄 河北安国 饮片 检出 检出 检出 0.12

4 姜黄 河北安国 饮片 未检出 未检出 未检出 /

5 姜黄 四川 饮片 检出 检出 检出 0.29

6 姜黄 河北安国 饮片 检出 检出 检出 0.22

7 姜黄 安徽亳州 饮片 未检出 未检出 未检出 /

8 姜黄 山东济南 饮片 检出 检出 检出 0.61

9 姜黄 安徽亳州 饮片 未检出 未检出 未检出 /

10 姜黄 安徽亳州 饮片 检出 检出 检出 0.86

11 姜黄 安徽亳州 饮片 检出 检出 检出 0.80

12 姜黄 河北安国 饮片 未检出 未检出 未检出 /

13 姜黄 安徽亳州 饮片 未检出 未检出 未检出 /

14 姜黄 安徽亳州 饮片 检出 检出 检出 0.49

15 姜黄 河北安国 药材 检出 检出 检出 0.55

16 姜黄 安徽亳州 饮片 未检出 未检出 未检出 /

17 姜黄 安徽亳州 饮片 检出 检出 检出 0.39

18 姜黄 安徽亳州 饮片 未检出 未检出 未检出 /

19 姜黄 安徽亳州 饮片 检出 检出 检出 0.73

20 姜黄 河北安国 饮片 未检出 未检出 未检出 /

21 姜黄 安徽亳州 药材 检出 检出 检出 0.44

22 姜黄 安徽亳州 饮片 未检出 未检出 未检出 /

23 姜黄 河北安国 药材 检出 检出 检出 0.37

24 姜黄 安徽亳州 药材 检出 检出 检出 0.34

25 姜黄 河北石家庄 饮片 检出 检出 检出 0.31

26 姜黄 山东济南 药材 未检出 未检出 未检出 /

27 姜黄 河北安国 饮片 检出 检出 检出 0.49

28 姜黄 河北安国 饮片 检出 检出 检出 0.63

29 姜黄 河北安国 饮片 未检出 未检出 未检出 /

30 姜黄 安徽亳州 饮片 检出 检出 检出 0.38

据薄层色谱法所显斑点颜色深浅和液相色谱峰的大小，判断用70%乙醇提取，提取率最高；提取方法采用加热回流和超声处理两种方法进行考察，结果超声处理优于回流提取。

从表2可以看出，30批样品中有18批检出金胺O，TLC法和HPLC法测定结果一致，并且HPLC-MS法具有高度的专属性，没有误判现象出现。

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（收稿日期：2015-04-18）