深圳地区救护野鸟中禽流感的流行病学监测

曾志燎，温暖玲，茹开卓，李瑜

（1.深圳市野生动物救护中心，广东 深圳 440300；2.深圳市真和丽生态环境建设有限公司，广东 深圳 440300）

深圳地区救护野鸟中禽流感的流行病学监测

曾志燎1，温暖玲2，茹开卓1，李瑜1

（1.深圳市野生动物救护中心，广东 深圳 440300；2.深圳市真和丽生态环境建设有限公司，广东 深圳 440300）

为调查深圳地区救护野鸟中禽流感感染状况，于2015年4月至2015年5月从深圳市野生动物救护中心放养区采集了野鸟肛拭子77份、野鸟血清11份，利用RT-PCR方法对拭子样品进行了AIV抗原检测；利用血凝抑制实验（HI）对血清样品进行H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9等5种血清型AIV抗体检测。结果显示：拭子样品的AIV-Ag抗原检测全部阴性；而血清样品中H5（Re-4）阳性数1份，阳性率为1/11；H9阳性数1份，阳性率为1/11；未检出H5（Re-6）、H5（Re-7）及H7阳性抗体。

野鸟；禽流感；抗原；抗体；检测

禽流感（Avian Influenza，AI）是由正粘病毒科A型流感病毒引起的-种急性、败血性传染病，几乎所有野生鸟类及家养禽类均可感染。2005年，中国青海湖上千只候鸟相继感染高致病性禽流感病毒死亡。令人关注的是2013年中国暴发的H7N9禽流感，其能感染人并导致人类死亡。新型H7N9禽流感病毒感染人类并导致高死亡率，可能源于候鸟携带病毒的变异。禽流感特别是高致病性禽流感已经严重危及到人类健康，并有进-步突破种间屏障形成人间流行的潜在可能。因此，需要深入了解野鸟中禽流感病毒的分布情况及其传播规律，为高致病性禽流感的防控工作提供参考。

深圳位于中国重要的水鸟迁徙三大路线之一“东亚-澳大利亚飞行路线”上，每年9月份到次年5月份之间，吸引着数以十万计的东半球国际候鸟迁徙途经或留在深圳。据记载，在深圳栖息的野生鸟类以鹭、鸥、雁等为主，共有389种，占全国鸟类总数的近1/3，占全球鸟类的1/30。其中包括黑脸琵鹭等珍稀濒危物种在内的50多种国家重点保护鸟类。对于这些野生鸟类（包括侯鸟和留鸟），目前尚缺乏有效的免疫与疫病监控措施。鉴于此，于2015年4月5月对深圳地区救护的野鸟进行了禽流感的流行病学监测，以期为有效控制或预防禽流感提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器高速台式冷冻离心机、荧光PCR检测仪、微量加样器、96孔V型微量反应板、组织匀浆器。

1.1.2 实验试剂75%乙醇；0.01 mol/L（pH 7.2）的PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）；H5、H7和H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；阿氏（Alsevers）液；鸡红细胞悬液；AIV标准抗原购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 方法

1.2.1 样品采集2015年4～5月从深圳市野生动物救护中心放养区采集野鸟肛拭子77份、野鸟血清11份（野鸟样品详细分类见表1）。

表1 野鸟样品详细分类

1.2.2样品处理采集的鸟血样采用受体破坏酶（RDE）去除待检血清中的非特异性抑制素，将4容量的RDE加入1容量的血清中，37℃水浴16h～18h，然后56℃水浴50min（破坏残余RDE的活性），4000r/min离心后取上清，再加入终浓度为100mL/L的测定用鸡红细胞悬液，摇匀，4℃过夜，1000r/min离心5min，取上清置于-20℃冰箱冻存备用；棉拭样品置于含有抗菌素的pH 7.4～7.6Hanks液的采样管内。棉拭样品及时送至实验室后，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。然后用灭菌毛细吸管反复吹打收集的溶液，以便打碎黏液。置4℃待其自然沉淀5～10min，离心取上清备用。

1.2.3 血凝抑制试验HI试验参照GB/T 18936-2003《高致病性禽流感诊断技术》进行。

1.2.4 H5、H7和H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法参照GB/T19438.2-2004《H5亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法》、GB/T19438.3-2004《H7亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法》和GB/T19438. 4-2004《H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法》进行。

2 结果

2.1 野鸟血清中AIV抗体HI试验结果经HI试验对不同亚型AIV抗H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9的检测，在受检的6种野鸟的11份血清中共检出不同亚型AIV阳性抗体2份，阳性率为2/11。其中，H5（Re-4）阳性数1份，阳性率为1/11；H9阳性数1份，阳性率为1/11；未检出H5（Re-6）、H5（Re-7）、H7阳性抗体。详细结果见表2。2.2棉拭样品AIV病毒的检测结果采用荧光RT-PCR试验对野鸟的肛拭样品进行H5、H7和H9亚型AIV的病原学检测，结果均为阴性。

表2 AIV抗体HI检测结果

3 讨论

3.1 禽流感病毒抗原检测2015年4～5月从深圳市野生动物救护中心放养区采集野鸟肛拭子作病原学监测，利用RT-PCR方法检测H5、H7、和H9亚型禽流感病毒结果均为阴性，又经流行病学调查也未见发病症状的野鸟，分析其存在可能性有二种：一是H5、H7和H9亚型禽流感病毒在深圳野生动物救护中心放养区鸟类中不存在该病毒的携带者，因此未见感染发病；二是有可能个别禽流感病毒携带者其感染处于相对稳定的状态，不向外排毒，因此检不出阳性，这些有待作进一步研究。

3.2 禽流感病毒血清抗体检测2015年4～5月采集深圳市野生动物救护中心放养区野鸟血清11份，利用HI试验对不同亚型AIV抗体{H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9}进行检测。其中1份红绿金刚鹦鹉血清H5N1（Re-4）亚型AIV抗体检测结果为阳性，1份环颈雉血清H9亚型AIV抗体检测结果为阳性。利用RT-PCR方法检测相同个体红绿金刚鹦鹉和环颈雉的肛拭子，H5和H9亚型禽流感病毒检测结果均为阴性。分析红绿金刚鹦鹉和环颈雉血清中检测出AIV阳性抗体原因是：人工养殖环节接种过禽流感疫苗，因为该红绿金刚鹦鹉是深圳海关查获非法入境的野生动物，环颈雉是森林公安查获非法售卖的野生动物，红绿金刚鹦鹉在南美洲经人工养殖出来的，并非在野外捕获的；该环颈雉也是人工养殖的，而不是来自野外。

[1]王湘予，等.青海湖地区野禽禽流感监测与分析[J].动物医学进展，2009，30（7）：20-22．

[2]Chen H，et a1.Avian Flu：H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl[J].Nature，2005,436：191-192．

[3]Grund CH，et al.Avian paramyxovirus serotype 1 isolates from the spina cord of parrots display a very low virul ence[J].Journal of Veterinary Medicine Series B Aims and Scope.2002.

[4]Grund CH，et al.Avian paramyxovirus serotype 1 isolates from the spina cord of parrots display a very low virul ence[J].Journal of Veterinary Medicine Series B Aims and Scope.2002.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．10.011

曾志燎（1985～），广东省河源市人，本科，兽医师，从事工作野生动物救护及野生动物疫源疫病监测等工作