奶牛乳房炎克雷伯氏菌的分离鉴定

2015-12-01贺番贺瑜孟宁生陈宇浩

畜牧兽医科技信息 2015年11期

关键词：氏菌乌兰察布克雷伯

贺番，贺瑜，孟宁生，陈宇浩

（内蒙古乌兰察布市集宁师范学院，内蒙古乌兰察布 012000）

奶牛乳房炎克雷伯氏菌的分离鉴定

贺番，贺瑜，孟宁生，陈宇浩

（内蒙古乌兰察布市集宁师范学院，内蒙古乌兰察布 012000）

奶牛乳房炎又名奶牛乳腺炎，是由病原微生物感染而引起乳房组织及乳头发炎的一种疾病，也是奶牛场最常见、防治最困难、花费成本最高的一种疾病，该病不仅影响产奶量和牛奶的品质，而且危及人的饮用安全，给我区的奶业造成巨大的经济损失。克雷伯氏杆菌是乳房炎的主要病原菌之一。本试验对乌兰察布市周边某小区奶牛养殖场中患乳房炎病牛的乳汁中进行了病原菌的分离，得到4株菌，分别编号为K1、K2、K3、K4。通过对它们的培养特性、形态以及染色特征的观察和对其进行生化特性的检测，以及进一步经动物实验鉴定表明这4株菌中有3株为克雷伯氏杆菌，通过上述微生物学诊断方法，表明该奶牛养殖场本次奶牛的乳房炎是与克雷伯氏杆菌感染有关，进一步的药敏试验表明该分离菌对庆大霉素最敏感，应将庆大霉素定为首选药物，其次是链霉素、头孢唑啉，该菌对青霉素耐药。

克雷伯氏菌；分离；鉴定

奶牛乳房炎是奶牛乳腺受到物理、化学、微生物刺激所发生的一种炎性变化，乳汁中体细胞含量增加，乳腺组织，受到不同程度的破坏，是奶牛的常发病之一。乳房炎对世界乳牛养殖业危害大，其发病率也相当高。据有关资料报道，国外奶牛乳房炎的发病率约为25%～60%，据我国有关部门不完全统计，乳房炎作为我国奶牛场最严重的疾病之一，发病率达20%～70%，造成的经济损失严重。目前，呼和浩特市地区乳业持续高速发展，奶业已经成为首府经济发展和农牧民致富奔小康的支柱产业，但由于饲养管理差，疾病的防治技术落后，个体养牛户滥用抗生素现象普遍，呼和浩特市也成为了乳房炎的多发地区。

引起乳房炎的各种因素中病原微生物达80多种，但绝大部分（＞95%）是由细菌引起的，其中克雷伯氏杆菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一。本研究对乌兰察布市周边某小区奶牛养殖场中患乳房炎病牛的乳汁进行病原菌分离鉴定，以期对牛乳房炎疫苗研制、筛选敏感药物和治疗等提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料乌兰察布市周边某小区奶牛养殖场中患乳房炎病牛的乳汁3份

1.1.2 培养基蛋白胨水溶液，三糖铁琼脂斜面，葡萄糖蛋白胨水溶液，甲基红试剂，VP试剂，枸橼酸盐培养基，麦康凯琼脂培养基，半固体普通琼脂培养基，生化鉴定培养基，氏尿素琼脂培养基

1.1.3 药敏纸片头孢唑啉、青霉素G、庆大霉素、链霉素，共4种（由中国药品生物制品检定所提供）。

1.1.4 实验动物内蒙古大学动物实验中心提供的10只健康小白鼠，体质量均在22g左右。

1.2 方法

1.2.1 分离培养将乳样接种到麦康凯平板上培养18h后取出，观察长出的菌落形态，根据落的形态、大小、颜色等将菌落大致分类，然后配合显微镜下检查观察细菌的形态、革兰氏染色特点仔细进行分类，排除环境中常存在的无致病性细菌，一般为革兰氏染色呈阴性的杆菌。将筛选细菌纯培养。

1.2.2 生化试验纯培养后镜检无杂菌者按有关生化鉴定方法进行生化鉴定，观察并记录结果。

1.2.3 药物敏感性试验吸取100μL分离到的细菌纯培养物，涂布于普通琼脂平板，室温放置表面干燥后将4种药物纸片按4片/平皿均匀贴于培养基表面。将平皿倒置于37℃温箱中持续培养18～24h，观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈直径并进行记录，判断病原菌对各种药物的敏感性。药物抑菌能力的判定按中国药品生物制品检定所、国家抗菌药物细菌耐药性监测中心提供的抗菌药物药敏纸片判断标准进行判断。

1.2.4 动物致病性试验将克雷伯氏菌液腹腔接种10只试验小白鼠，每只注射0.2×107个菌，观察小白鼠的临床症状及死亡率。

2 结果

2.1 培养基形态特点和涂片染色镜检结果

克雷伯氏菌麦康凯培养基上可形成黏液状浓厚、圆凸、闪光、丰盛的菌落，以接种环挑之易成丝。菌株革兰氏染色为阴性，呈杆状（图1，图2）。

图1

图2

2.2 生化试验结果

按照《常见细菌系统鉴定手册》所介绍相应的科属下的各个种的生理生化指标为依据，经细菌培养特性，菌落形态，生化特性等鉴定表明：本实验分离的4种菌有3株为克雷伯氏菌。

依据《常见细菌系统鉴定手册》，从菌落形态，染色特性，溶血情况及各项生理生化特性可以判定K1、K2、K3为克雷伯氏菌。

2.3 药敏实验结果

从试验结果可以看出我们所分离出的4株菌中对庆大霉素敏感率最高，结果表明此牛场奶牛乳房炎病原菌对庆大霉素敏感，对其它类药物均产生不同程度的耐药性（表2）。

表2 药敏实验结果

2.4 动物实验结果

接种克雷伯氏菌的10只试验小白鼠均在初期精神沉郁，呼吸加快等症状，24h开始死亡，最终7只实验鼠死亡，死亡后剖检可见腹腔粘液增多，脾脏肿大出血，胰腺有出血点，肺脏严重充血增大等病变。

3 讨论

经过对牛场饲养管理、卫生条件和消毒措施的调查结果，结合对奶牛环境性乳房炎病原的分离鉴定，表明奶牛环境性乳房炎主要是由环境性病原菌感染引起的。本研究对乌兰察布市周边某小区奶牛养殖场中患乳房炎病牛的乳汁中进行了病原菌的分离，得到4株疑似的克雷伯氏菌，通过常规实验室细菌的分离与鉴定，确定其为克雷伯氏菌，药物敏感性表明本次分离到的克雷伯氏菌对庆大霉素敏感，本研究对于研制有效的疫苗、筛选敏感药物预防和治疗内蒙地区乳房炎具有重要意义。

同时本研究结果表明乌兰察布地区克雷伯氏菌引发奶牛乳房炎较为严重，应该予以重视。目前，该地区奶牛主要舍内饲养，由于动物的活动受到限制以及环境性病原菌（主要是大肠杆菌、克雷伯氏菌、乳房链球菌及停乳链球菌）在牛体外环境的繁殖，从而增加了乳头感染的机会，促使乳房炎的发生。因此，保持良好的环境卫生防止细菌的繁殖是预防的关键。预防环境性乳房炎建议加强饲养管理，增强奶牛体质，同时做好奶牛乳房炎的检测工作，发现病牛及时隔离，并及早进行治疗，以防止病原的蔓延扩散，对新引进的奶牛要进行隔离检查。