一种用于检测恶性疟原虫的双环引物环介导等温扩增方法

吕沁风，姜侃，杨永耀，何蕾，罗鹏，吴忠华

1.浙江国际旅行卫生保健中心，浙江 杭州 310003；2.浙江省质量监督检测研究院，浙江 杭州 310003

恶性疟是由恶性疟原虫感染引起的疟疾，目前高发于非洲和东南亚热带地区。根据WHO的报道，每年约有65 万人死于恶性疟，57%的非洲人口仍然生活在恶性疟流行的高发地区，在非洲南部恶性疟仍是住院的主要原因，同时给这些地区带来了沉重的经济负担[1-2]。恶性疟潜伏期为9～14 d，平均12 d；常见发冷、发热、出汗等症状，与重症流行性感冒相似；发作周期一般为36～48 h。免疫力低下人群，如未及时治疗或治疗不当易发展为重症疟疾，甚至脑型疟而死亡。国内目前恶性疟主要来源于输入性感染，且存在疟疾的传播媒介按蚊，开发快速检测方法，对恶性疟的防治具有重要的意义。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型核酸扩增技术，该方法针对靶基因的6 个区域设计4 种引物，在等温条件60℃～65℃下利用Bst聚合酶即可进行109～1010倍的核酸扩增[3-4]。LAMP 产物通过浊度或荧光变化可用肉眼观察，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优点[5-6]。自2000 年问世以来，LAMP 技术在病原体检测、疾病诊断等领域得到广泛应用[7-10]。目前，如何在现有LAMP 技术的基础上发掘更高效快速的等温扩增方法，成为重要的研究方向。最快速的LAMP反应方法就是加入环引物[11-12]。本研究的目的在于缩短等温扩增的反应时间，达到比加入环引物更快的扩增效率：把LAMP 的环引物由1 对增加至2 对，在进行等温扩增反应时，2 对环引物能同时和反应回环的产物进行贴合，亦即在退火的同时启动了再回环的扩增，从而增加了反应进程，缩短反应时间，达到快速检测的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

2011～2014 年口岸截获的疟疾感染者全血标本为本室保存。

DNA 提取试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；BstDNA 聚合酶购自NEB 公司；ExTaq酶、dNTP、DL2000 DNA marker、琼脂糖凝胶购自TaKa-Ra 公司；MgSO4和甜菜碱为Sigma-Aldrich 公司产品；EvaGreen 购自Biotium 公司；2720 型PCR 仪购自ABI公司；Chromo 4型荧光定量PCR仪、电泳仪购自BIO-RAD公司。

1.2 引物设计

常规LAMP 技术含有1 对外引物、1 对内引物，选择加入1 对环引物，可在等温条件下进行核酸扩增。本研究根据恶性疟原虫18S rRNA 基因保守区设计了 一组引 物[13-14]，分别为F3、B3、FIP、BIP、fLoop1、fLoop2、bLoop1 和bLoop2，第2 对环引物的加入，使等温扩增回环的速率增加，从而缩短反应的时间。引物序列见表1。

1.3 恶性疟原虫DNA的提取

严格按QIAGEN DNA 抽提试剂盒说明书提取DNA，-20℃保存。

1.4 反应体系及反应条件

快速LAMP 反应体系：10×缓冲液2.5 μL，引物混合 物1 μL（F3、B3 各1 μmol/L，FIP、BIP 各15 μmol/L，fLoop1、fLoop2 各5 μmol/L，bLoop1、bLoop2各15 μmol/L），模板DNA 1 μL，8 UBstDNA 聚合酶1 μL，甜菜碱（8 mol/L）2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.2 μL，1.25 μL 20×的EvaGreen，加入灭菌双蒸水补足25 μL。

加入环引物的LAMP 引物混合物为F3、B3 各1 μmol/L，FIP、BIP 各15 μmol/L，fLoop1、fLoop2 各5 μmol/L，其他成分与双环引物LAMP一致。

反应条件：63℃ 55 s，荧光采集5 s，100 个循环。反应在荧光定量PCR仪中进行。

1.5 灵敏度试验

以DNA 为模板，用PCR 混合引物进行扩增，将PCR 产物纯化回收试剂盒进行纯化回收，对纯化后的PCR产物测定D260nm值，根据产物长度和D260nm值计算拷贝数，将产物以1/10 梯度稀释，最终稀释到1×100拷贝/μL。分别取1 μL 作为模板加入反应体系中，在63℃恒温条件下反应60 min。在荧光定量PCR 仪上观察实时荧光反应曲线，反应结束后进行65℃到95℃溶解曲线试验，每增加1℃保温30 s，检测荧光强度，试验结束后取2 μL 反应产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，同时用外引物进行PCR反应检测灵敏度。

表1 恶性疟原虫快速LAMP扩增引物

1.6 特异性试验

同时提取间日疟、卵形疟和三日疟等感染者全血核酸，同时用双环LAMP方法进行检测。

1.7 重复性试验

根据灵敏度试验结果，选择阴性、1×100拷贝/μL和1×106拷贝/μL 浓度的cDNA 模板分别进行快速LAMP，每份样本各取1 μL 重复3 次，采用实时荧光定量PCR 仪进行检测，观察反应的Ct 值，根据Ct 值计算变异系数，对该方法的重复性进行考核。

1.8 样本检测

采用该方法对全省口岸送检的29 例全血标本及30例健康体检者全血标本进行检测，观察结果。

2 结果

2.1 灵敏度试验结果

在荧光定量PCR 仪上观察实时荧光反应，结果见图1；取2 μL 反应产物进行10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，结果见图2，1～5 泳道均出现细密的阶梯状条带，表示有阳性扩增反应。可以判定本方法的检测极限约为1×101拷贝/μL。PCR 灵敏度试验结果见图3，可见检测限为1×102拷贝/μL。经比较双环引物LAMP 检测方法的灵敏度比PCR 法高一个数量级。溶解曲线试验结果见图4，可见每个不同浓度的产物溶解曲线温度都在同一点上。

2.2 特异性试验结果

采用恶性疟快速LAMP 方法进行检测，电泳反应结果见图5，恶性疟出现与普通LAMP 反应相同的的阶梯状条带。此外，阴性对照、间日疟、卵形疟、三日疟核酸的检测结果均为阴性，由此显示了该方法具有很好的特异性。

2.3 重复性试验结果

根据实时荧光LAMP 的结果，记录各次试验的Ct 值。根据Ct 值计算SD值及变异系数（CV），结果见表2，强阳性及临界值样本的CV值均小于5%，重复性良好。

2.4 2种扩增方法的反应时间比较

根据实时荧光检测结果可见，快速LAMP 的反应时间最快可达15 min 左右，加入环引物的LAMP反应时间为25 min左右。实时荧光检测见图6。

2.5 临床样本检测

采用快速LAMP 技术进行检测，发现29 例口岸送检本实验室的样本中有8 例恶性疟阳性，与荧光定量PCR 检测结果相符。30 例健康体检者检测结果全部为阴性。

3 讨论

环介导等温扩增技术由于操作简单、不需要昂贵的专用实验仪器、反应在1～1.5 h 内完成、灵敏度高，而吸引了大量研究力量投入该领域的研究。我们改进的方法缩短了检测时间，在实际检测应用中和定量PCR 检测结果相符，证明本检测方法具有应用价值。但2对环引物设计比1对引物设计要困难，对于扩增片段太短和能设计引物的位置太少的核酸检测并不适合。对能设计双环引物的LAMP 扩增来说，能不能真正提高扩增效率需要通过大量实验进行验证。

图1 恶性疟原虫双环引物LAMP灵敏度检测实时荧光结果

图2 恶性疟原虫双环引物LAMP产物电泳结果

图3 恶性疟原虫PCR产物电泳结果

表2 恶性疟原虫双环引物LAMP重复性实验结果

图4 恶性疟原虫双环引物LAMP产物溶解曲线试验

图5 双环引物LAMP特异性试验结果

图6 双环引物和环引物扩增速度比较

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