人表皮生长因子受体结构域蛋白的原核表达、纯化及活性检测

郭靖 ，王涛，李齐宏，李玲，梁迎春，洪甜，梅国徽，冀全博，纪贝贝，徐小洁，叶棋浓

1.大连医科大学 肿瘤干细胞研究院，辽宁 大连 116044；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；3.军事医学科学院 附属医院，北京 100071

表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）是Ⅰ型受体酪氨酸激酶家族成员[1]。EGFR 是一种跨膜糖蛋白、细胞膜受体，其基因位于人类第7 号染色体短臂上。EGFR 由1186 个氨基酸残基构成，相对分子质量为170×103，由胞外区、胞内配体结合区、跨膜区三部分组成[2]。胞外区包含L-1/2两个富含亮氨酸序列和CR-1/2两个富含半胱氨酸序列，是621 个氨基酸残基构成的与配体结合的N端区；跨膜区是23个氨基酸残基构成的α螺旋；胞内区由近膜区（juxtam embrane region，JM）、酪氨酸蛋白激酶区和C 端构成，含有542 个氨基酸残基。受其相应配体诱导激活之后，EGFR 可参与细胞信号通路，通过不同的受体类型和磷酸化结合位点，激活不同的信号蛋白，参与细胞分化、增殖、迁移、侵袭和损伤修复[3]。因此，EGFR 发挥生物学效应依赖于其胞外区和胞内激酶区的完整性及稳定性。

为了进一步探索EGFR 在肿瘤发生发展中的具体功能，我们将EGFR 的胞外结构域（extracellular domain，ED）和胞内激酶结构域（protein kinase domain，PKD）分别构建在原核表达载体上，表达获得融合蛋白GST-EGFR-ED 和GST-EGFR-PKD，为深入研究EGFR在肿瘤中的作用奠定了实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、Rossate，原核表达载体pGEXKG 为本室保存；DNA 胶回收试剂盒、PCR 产物回收试剂盒为北京天根生物科技有限公司产品；XbaⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶、Prime STAR HS DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶为TaKaRa 公司产品；质粒提取试剂盒为Promega 公司产品；GST-Sepharose 4B 珠子购自Pharmacia 公司；DMEM 及小牛血清均购自Gibco 公司；VigoFect 为威格拉斯生物技术有限公司产品；辣根过氧化物酶偶联的抗GST、Flag 单克隆抗体购自Sigma 公司；引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；测序由北京奥科生物技术公司完成。

1.2 人EGFR ED、PKD编码基因的扩增

分别设计人EGFR ED 和PKD 基因扩增引物序列（表1），上、下游引物分别含XbaⅠ和XhoⅠ酶切位点。以人乳腺文库为模板，用Prime STAR HS DNA聚合酶PCR 扩增目的片段。扩增条件：95℃5 min预变性；95℃30 s、58℃30 s、72℃130 s，32 个循环；72℃延伸50 s。扩增产物以1.5%琼脂糖DNA 胶检测，用琼脂糖DNA胶回收试剂盒回收。

1.3 重组表达质粒的构建及原核表达鉴定

EGFR ED 和PKD 胶回收产物用XbaⅠ、XhoⅠ双酶切，载体pGEX-KG也经相同酶双酶切胶回收载体大片段；酶切产物经T4DNA 连接酶于16℃连接4 h 后，转化大肠杆菌DH5α，涂LB（含氨苄西林）平板，37℃培养过夜；挑选单克隆，做菌液PCR，再挑选阳性克隆，接种于LB（含氨苄西林）培养基中，37℃振荡活化14 h；提取质粒进行双酶切鉴定，正确质粒送北京奥科生物技术公司测序。

1.4 融合蛋白的小量诱导表达及鉴定

将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌Rossate 感受态细胞，挑取单个菌落，37℃振荡培养至D600nm为0.6～1.0，加入IPTG 至终浓度1 mmol/L，诱导4 h后收集菌液离心，菌体行Western印迹检测。

1.5 融合蛋白的纯化

将小量诱导表达的重组Rossate 菌和含有pGEX-KG 空载体的Rossate 菌接种于LB（含氨苄西林）培养基中，37℃振荡活化过夜；按10%的比例转接同种液体培养基中，29℃振荡培养至D600nm为0.4～0.6时加入IPTG 至终浓度0.1 mmol/L，19℃继续培养20～24 h；离心收集菌体，按Pharmacia 公司提供的纯化方法行蛋白纯化：加入裂解液，超声波破碎菌体，12 000 r/min 离心收集上清，加入适量GST-Sepharose 4B珠子，4℃旋转结合3 h，3000 r/min低速离心收集珠子，缓冲液充分洗脱未结合蛋白质，以Western印迹鉴定纯化的蛋白，作为诱饵蛋白。

2 结果

2.1 人EGFR ED、PKD编码区基因的克隆

以人乳腺文库为模板，按前述条件分别扩增EGFR ED 和PKD 编码序列，获得的ED 片段大小为582 bp，PKD为811 bp，与预期一致（图1）。

2.2 重组表达载体pGEX-GST-EGFR-ED、pGEXGST-EGFR-PKD 的构建与鉴定

用Xba Ⅰ和XhoⅠ双酶切EGFR ED、PKD 的PCR 产物，分别与经同样酶切的pGEX-KG 载体连接，2种连接产物均转化大肠杆菌DH5α，涂布LB（含氨苄西林）平皿，挑取克隆提质粒进行酶切鉴定，得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段，对照空载体双酶切后无此片段，表明EGFR ED、PKD 基因的编码序列已正确插入载体上游的多克隆位点中。DNA 测序结果显示，插入表达载体pGEX-KG中的EGFR ED 和PKD 编码序列完整，方向正确，无突变发生（数据略）。见图2、3。

2.3 融合蛋白GST-EGFR-EDG 和GST-EGFRPKD的诱导表达及鉴定

图1 目的基因的PCR扩增

将pGEX-KG 空载体、pGEX-EGFR-ED 和pGEX-EGFR-PKD 融合表达质粒分别转化大肠杆菌Rossate 感受态细胞，经IPTG 小量诱导后，Western 印迹检测，GST-EGFR-ED 和GST-EGFR-PKD 融合蛋白获得正确表达（图4）。

2.4 融合蛋白GST-EGFR-ED、GST-EGFR-PKD 的纯化

利用GST-Sepharose 4B 亲和珠子纯化获得融合蛋白，考马斯亮蓝染色检测结果显示获得一定量的纯度较高的GST、GST-EGFR-ED 和GST-EGFRPKD融合蛋白（图5）。

2.5 GST pull-down分析

图2 重组质粒pGEX-GST-EGFR-ED 和pGEX-GST-EGFR-PKD 的菌液PCR电泳结果

图3 重组质粒的双酶切鉴定

图4 融合蛋白的Western印迹分析

为进一步研究纯化的GST-EGFR-ED 和GSTEGFR-PKD 能否与Memo（mediator of ErbB2-driven cell motility）蛋白相互作用，将带有GST-EGFRED 和GST-EGFR-PKD 的纯化珠子与过表达Myc-Her2 的293T 细胞裂解液于4℃结合后，用Myc-Her2抗体行Western 印迹检测。结果显示，GST-EGFRPKD 可与Myc-Her2 结合，在符合Myc-Her2 大小的相对分子质量约180×103位置显示出特异性条带（图6），而GST 载体蛋白及GST-EGFR-ED 在同一位置无此条带，说明GST-EGFR-PKD 能够与Myc-Her2特异地相互作用，GST 标签并不影响蛋白的结构及生物学功能。

3 讨论

细胞表面EGFR 的表达是其下游信号转导通路激活的基础，也是原癌基因的表达产物[4]。EGFR 在多种肿瘤中高表达，可促进血管生成及肿瘤细胞的增殖、黏附、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡[5-7]。并且，EGFR 过度表达的细胞表现出对促凋亡药的抵抗性[8]。另外，EGFR 直接参与肿瘤发生、发展过程[9]。EGFR 的活化需要经过3 个过程[10]：①EGFR 与配体结合后导致受体形成同源二聚体，也可与其他EGFR 家族成员形成异源二聚体；②形成的二聚体促使EGFR 胞内区6 个特异的受体酪氨酸残基磷酸化，分别将外界各种信号转导至胞内；③当细胞核接收到信号传导后，核内的基因转录水平增加，EGFR的表达增加。

图5 纯化的GST-EGFR-ED、GST-EGFR-PKD 融合蛋白SDS-PAGE分析

图6 GST pull-down检测目的蛋白与Myc-Her2蛋白的相互作用

Her2 过表达引起Ras/MAPK、PI3K/Akt 等信号通路的一系列反应[11-12]。王琼等证明Her2 和EGFR正相关，并推测两者可能在肿瘤的发生和转移等方面存在协同作用[13]。同时，Ling等证明EGFR和Her2之间存在相互作用[14]。本实验构建了EGFR 不同区域的原核表达载体，并与Her2 进行了GST pulldown 实验，结果显示Her2 结合在EGFR 胞内激酶区，而不与EGFR 胞外区结合。这可以解释Her2 与EGFR 正相关并能协同影响信号通路的现象，为进一步研究两者的功能提供了另一条途径。

EGFR 是具有良好前景的肿瘤诊断和治疗靶点。阻断EGFR 表达的靶向抑制剂能够增加肿瘤细胞的放射敏感性，提高放射治疗的疗效，其机制可能是EGFR 的靶向抑制剂抑制了肿瘤细胞的EGFR 表达，阻断了EGFR 信号传导通路，从而加速细胞凋亡，干扰细胞周期分布及细胞辐射后DNA 损伤的修复[15]。但是，EGFR 在肿瘤发生、发展及预后等方面中的具体作用机制还有待探究。我们克隆了GSTEGFR-ED 和GST-EGFR-PKD 基因并获得其原核表达融合蛋白，为后续进一步研究其在肿瘤发生发展、蛋白相互作用及抗体制备等方面的作用奠定了实验学基础。

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