鞣花酸对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

杨丽娜，乔 楠，胡敏予，陈继华，林 茜，周光宇，魏 薇，朱柳凤

（中南大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，湖南 长沙 410078）

近年来，酒精性肝损伤患病人数逐年增加，已成为一种世界性疾病，给家庭和社会带来极大负担。酒精性肝损伤是由于长期、大量饮酒或其他含乙醇的饮料所导致的以肝脏损害为主的病理改变，初期通常表现为酒精性脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。对酒精性肝损伤进行预防干预可减少其发病率，对于减轻其危害有重要意义。鞣花酸是一组天然多酚类化合物，广泛存在于各种植物组织中。鞣花酸是没食子酸的二聚衍生物，具有酚类化合物的结构，其药理作用多样，生物活性较强［1－2］，多项研究［3－7］表明：鞣花酸有明显的清除自由基、抑制细胞凋亡、抗氧化、促凝血、抗肝损伤和抗肿瘤等作用。但国内至今尚未见鞣花酸对酒精性肝损伤预防作用的研究报道。本研究通过建立酒精性肝病小鼠模型，探讨鞣花酸对酒精性肝损伤的保护作用，阐明其可能的作用机制，为鞣花酸应用于酒精性肝病的预防和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 昆明小鼠50只，雌雄各半，体质量为18～22g，SPF级，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK （湘）2009－0012。鞣花酸粉剂 （90%）购自陕西锦泰生物工程公司，无水乙醇购自天津市大茂化学试剂厂，超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛 （MDA）和谷光甘肽 （GSH）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。全自动生化分析仪（AU2700，日本奥林巴斯公司），酶标仪 （Power Waves XSC2，美国MD公司）。

1.2 动物分组和模型制备 50只昆明小鼠，雌雄各半，随机分为空白对照组，肝损伤模型组和低、中、高剂量鞣花酸组，每组10只。空白对照组和肝损伤模型组小鼠给予1%羧甲基纤维素钠溶剂灌胃，不同剂量鞣花酸组小鼠分别以160、320和480mg·kg－1鞣花酸灌胃，连续15d。末次灌胃后，空白对照组小鼠灌胃等量蒸馏水，其他组小鼠灌胃50%乙醇12mL·kg－1，禁食不禁水，16h后小鼠眼球取血，颈椎脱臼法处死动物，解剖，取出肝脏，称质量，计算肝脏系数。肝脏系数＝脏器湿质量／体质量。

1.3 检测指标和方法 各组小鼠眼球取血，4000r·min－1离心10min，分离血清，全自动生化分析仪测定血清、丙氨酸氨基转移酶 （ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶 （AST）活性和甘油三酯（TG）水平。取肝右叶组织块，称质量，以1∶9的比例量取冰冷生理盐水，肝脏组织与生理盐水一同倒入匀浆器的玻璃容器中，匀浆，制成10%组织匀浆，3000～4000r·min－1离心10～15min，取上清液，4℃保存，分光光度计法测定各组小鼠肝组织中SOD和GSH活性以及MDA水平。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠血清ALT、AST、SOD、GSH活性及TG、MDA水平以表示，组间均数比较采用单因素方差分析。以α＝0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 各组小鼠肝脏系数 与空白对照组比较，肝损伤模型组和低剂量鞣花酸组小鼠肝脏系数升高（P＜0.05或P＜0.01）；与肝损伤模型组比较，低、中、高剂量鞣花酸组小鼠肝脏系数降低（P＜0.01），各剂量鞣花酸组小鼠肝脏系数比较差异有统计学意义 （P＜0.01），且鞣花酸剂量越高小鼠的肝脏系数降低越明显。见表1。

2.2 各组小鼠血清ALT和AST活性及TG水平与空白对照组比较，肝损伤模型组小鼠血清ALT和AST活性及TG水平明显升高 （P＜0.05），表明造模成功。低、中和高剂量鞣花酸组小鼠血清ALT和AST活性均明显低于肝损伤模型组 （P＜0.01），高剂量鞣花酸组小鼠血清TG水平明显低于肝损伤模型组 （P＜0.05）。见表2。

，g·100g－1）

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＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group；△P＜0.05，△△ P＜0.01compared with model group；#P ＜0.05 compared with low dose of ellagic acid group；○ P ＜0.05 compared with medium dose of ellagic acid group.

GroupLiver index Control 5.86±0.41 Model 8.21±0.18＊＊Ellagic acid Low dose 7.09±0.79＊△Medium dose 6.49±0.37△△#High dose 5.55±0.41△△#○

2.3 各组小鼠肝组织中SOD和GSH活性及MDA水平 与空白对照组比较，肝损伤模型组小鼠肝组织匀浆中SOD和GSH活性明显降低 （P＜0.05或P＜0.01），MDA 水平明显升高 （P＜0.01）；低、中和高剂量鞣花酸组小鼠肝组织中SOD活性明显高于肝损伤模型组 （P＜0.05或P＜0.01），MDA水平明显低于肝损伤模型组（P＜0.05或P＜0.01）；中和高剂量鞣花酸组小鼠肝组织中GSH活性明显高于肝损伤模型组 （P＜0.05）。见表3。

表2 各组小鼠血清ALT和AST活性及TG水平Tab.2 Activities of serum AST，ALT and levels of TG of mice in various groups （n＝10，）

表2 各组小鼠血清ALT和AST活性及TG水平Tab.2 Activities of serum AST，ALT and levels of TG of mice in various groups （n＝10，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with model group.

Group ALT［λB／（U·L－1］AST［λB／（U·L－1］TG［cB／（mmol·L－1）］Control 32.03±8.24 77.54±11.21 1.00±0.38 Model 96.45±8.52＊＊ 146.68±35.37＊＊ 1.77±0.39＊Ellagic acid Low dose 78.74±7.20△△ 103.83±14.69△△1.62±0.23＊Medium dose 54.57±7.23△△ 92.44±8.03△△ 1.56±0.24＊High dose 36.53±9.19△△ 79.19±7.45△△ 1.12±0.43△

表3 各组小鼠肝组织中SOD和GSH活性及MDA水平Tab.3 Activities of SOD，GSH and levels of MDA in liver tissue of mice in various groups （n＝10，）

表3 各组小鼠肝组织中SOD和GSH活性及MDA水平Tab.3 Activities of SOD，GSH and levels of MDA in liver tissue of mice in various groups （n＝10，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01compared with model group.

Group SOD［λB／（U·mg－1）］GSH［λB／（U·mg－1）］MDA ［mB／（mmol·g－1）］Control 209.47±29.25 4.35±0.29 4.19±1.02 Model 74.59±15.14＊＊ 1.06±0.41＊ 11.57±0.92＊＊Ellagic acid Low dose 107.61±12.01△1.76±0.61＊ 7.04±1.73△△Medium dose 145.34±22.06△△ 2.54±0.51△ 5.97±2.41△△High dose 200.79±23.73△△ 3.66±0.57△ 4.82±1.81△△

3 讨 论

肝脏在身体中扮演着一个巨大的 “化工厂”的角色，其通过各种生物化学反应发挥代谢解毒、免疫防御和消化吸收等功能。从各种途径进入人体的外源化学物以及体内代谢产生的有毒有害物质，最终都要在肝内转化或储留，这些有毒有害物质均可能导致急、慢性肝损伤，引起肝细胞坏死、凋亡、炎症发生和纤维化等病理改变。酒精性肝损伤是长期大量饮酒或各类含酒精的饮料所致，通常以酒精性脂肪肝为最初表现，若病变继续，可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化，最终发展成肝硬化。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死甚至肝功能衰竭。乙醇对肝损害的机制十分复杂，目前尚未完全阐明，可能乙醇代谢过程中产生乙醛，乙醛可与蛋白质形成加和物，该加和物有直接损伤肝细胞的作用，并且可作为新产生的抗原诱导机体自身免疫反应，加重肝细胞的损伤；肝微粒体乙醇氧化酶系统被激活后，产生的活性氧对肝组织有损伤作用［8］。酒精性肝损伤时血清AST、ALT和TG等指标也可有不同程度的改变。

另外，在肝病的发生过程中，氧化应激起着非常重要的作用，各类肝损伤和肝病大多伴随着氧化还原过程的失平衡。为了抵抗各种原因引起的氧化应激，机体自身具有严密的抗氧化机制，包括非蛋白硫基如GSH，各种抗氧化酶如SOD等。然而机体的氧化系统与抗氧化系统在机体遭受到某些有害刺激时可能导致失衡，使大量氧自由基在肝细胞内堆积，使细胞膜脂质过氧化，因而导致过氧化产物MDA水平升高；另外还有细胞器功能异常以及炎症反应，最终危害肝脏。故肝组织中的GSH、SOD活性和MDA水平可以作为反映肝损伤程度的敏感指标［9－11］。鞣花酸又名胡颓子酸，是没食子酸的二聚衍生物。鞣花酸以游离形式或结合形式广泛存在于多种水果、坚果和蔬菜中，尤以结合形式为主，例如鞣花单宁及葡萄糖甙等［12－13］。鞣花酸在结构上是一种多酚二内酯，具有酚类抗氧化剂的特性，鞣花酸具有显著的抗氧化能力，抗氧化活性是维生素E的50倍，在一些国家已被允许作为食品抗氧化剂使用。

酒精性肝损伤在临床上是脂肪性肝病的一类病理综合征，由脂类物质在肝脏过度沉积所致，脂类物质以TG为主。脂肪在肝脏中的氧化需经历多个阶段，每个阶段均与自由基有密切关系［14－15］，脂质氧化反应的发生以自由基的生成为必要条件，因而清除自由基即可阻断脂质的氧化反应。鞣花酸具有酚类抗氧化剂的特性，而酚类抗氧化剂的抗氧化机制主要是通过发生抽氢反应来实现的。在此过程中产生的苯氧自由基可阻断链式反应，产生的苯氧自由基越稳定，该抗氧化剂清除自由基的活性就越强［16－18］。鞣花酸具有邻苯二酚型酚羟基，因此可通过抽氢反应与另一个酚羟基相互作用，形成分子内氢键，从而构成一种共振结构，这一结构可使苯氧自由基更为稳定。另外，鞣花酸分子中相对位置具有的氧原子在P轨道上存在孤对电子，也构成了一种共振结构。该2种共振结构可以使邻位和对位的苯氧自由基具有更好的稳定性，因而使鞣花酸具有较高的清除自由基的活性。另有研究［1－3］表明：由于鞣花酸可与二价阳离子结合，当二价金属离子如镁离子、钙离子等存在时，金属离子对反应起到催化作用，鞣花酸可通过与金属离子的络合反应抑制自由基的生成。鞣花酸的这些独特化学性质使其具有较好清除自由基的能力，从而可中断氧化反应的链式进程，表现出较强的抗氧化活性。

本研究结果显示：小鼠灌胃给予50%乙醇16h后，与空白对照组比较，肝损伤模型组小鼠血清ALT和AST活性均升高，SOD活性降低，MDA水平升高，说明酒精性肝病模型的建立成功，而各剂量鞣花酸组小鼠血清ALT、AST活性和TG水平明显降低，SOD和GSH活性升高而MDA水平降低，以高剂量鞣花酸组小鼠灌胃效果最明显，提示鞣花酸可能通过其抗氧化作用来实现对肝细胞损伤的保护作用，其具体机制有待进一步探讨。

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