复方痔疮栓的定性鉴别与定量分析方法研究

许本善 雷 宁 马 萍 陈靖婕 吴 诚 童卫杭

解放军第二炮兵总医院药学部，北京 100088

复方痔疮栓的定性鉴别与定量分析方法研究

许本善 雷 宁 马 萍 陈靖婕 吴 诚 童卫杭

解放军第二炮兵总医院药学部，北京 100088

目的完善复方痔疮栓的质量控制标准，保障制剂质量。 方法采用薄层色谱法对复方痔疮栓制剂中的黄连、三七、冰片、血竭进行定性鉴别，用高效液相色谱法对制剂中的盐酸小檗碱进行含量测定。色谱条件：色谱柱为WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调pH至3.0）（30∶70），流速为1.0 mL/min，柱温为40℃，检测波长为345 nm。 结果薄层色谱法斑点清晰，分离度良好，阴性对照无干扰；盐酸小檗碱线性范围为2.7148～173.7468 μg/mL（r=0.9999，n=6），平均加样回收率为102.43%，RSD= 0.34%（n=6）。 结论该方法简便易行，适用于医院制剂复方痔疮栓的定性鉴别与定量测定。

复方痔疮栓；盐酸小檗碱；薄层色谱法；高效液相色谱法；定性鉴别；定量分析

复方痔疮栓系解放军第二炮兵总医院（以下简称“我院”）特色制剂[总制字（2011）F07005]，具有活血化瘀、收敛、消炎止痛作用，用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期内痔手术后、直肠炎、肛窦炎等。该制剂是将黄连、三七粉、冰片、血竭、龙骨、儿茶、煅赤石脂、醋乳香、醋没药共9味药材细粉，与热熔的混合脂肪酸甘油酯混匀至近凝后，注入模具冷却制得，该制剂来源于我院多年临床经验，疗效确切。该制剂原质量标准制订于20世纪90年代，未对其中主要药味及其活性成分进行定性、定量检测。为了更好地控制制剂质量，本研究优化了制剂中黄连、三七、冰片的薄层鉴别方法，并增加了血竭的薄层鉴别方法，同时考察并建立了制剂中盐酸小檗碱的高效液相色谱法含量测定方法。本研究结果表明，所建立的定性鉴别和定量测定方法具有较好的灵敏度和重现性，且操作简便，能够为医院制剂复方痔疮栓的质量标准的建立提供研究依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱系统（LC-20A型，日本Shimadzu公司，包括DGU-20A3脱气机、LC-20AT二元泵、SIL-20A自动进样器、CTO-10A柱温箱、SPD-M20A二极管阵列检测器、SPD-20A紫外检测器以及LCSoLution色谱工作站）；电子天平（JM-B20002型，浙江省余姚市纪铭称重校验设备有限公司）；十万分之一分析天平（CP225D型，德国Sartorius公司）；电热恒温水浴锅（HWS28型，上海一恒科技有限公司）；超声波发生器（KQ-500V型，苏州昆山超声仪器有限公司）；旋转蒸发器（RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9070A型，上海一恒科技有限公司）；紫外分光光度仪（ZF-I型，上海顾村电光仪器厂）；薄层色谱扫描成像系统（Reprostar 3型，瑞士CAMAG公司）；超纯水系统 （Synergy UV型，美国Millipore公司）。

1.2 试药

复方痔疮栓（批号：20120320、20141024、201503-183，我院药学部）；黄连、三七、血竭对照药材（批号分别为120913-201310、120941-201108、120906-200609，中国食品药品检定研究院）；盐酸巴马汀（纯度：86.2%，批号：110732-201108）、盐酸小檗碱（纯度：86.7%，批号：110713-201212）、冰片（鉴别，批号：743-8902）、三七皂苷R1（纯度：94.0%，批号：0754-200008）、人参皂苷Rg1（纯度：95.0%，批号：0703-200117）、人参皂苷Re（纯度：92.7%，批号：0754-9913）、人参皂苷Rb1（纯度：93.7%，批号：110704-200420）、血竭素高氯酸盐（纯度：99.2%，批号：0811-9302）对照品购自中国食品药品检定研究院；表小檗碱（纯度：98.02%，批号：130413）、黄连碱（纯度：98.55%，批号：130809）对照品均购自成都普菲德生物技术有限公司；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，甲醇、乙醇、正丁醇、香草醛、冰醋酸、盐酸、硫酸、乙酸乙酯、磷酸二氢钠、甲苯、石油醚（60～90℃）、二氯甲烷均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱法鉴别

2.1.1 黄连

取本品1粒，切碎，加甲醇25 mL，密塞，水浴（60℃）30 min，冷却，滤过，滤液作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.05 g，加甲醇25 mL，同法制成对照药材溶液。再取表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品，分别加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述6种溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-甲醇-冰醋酸-水（14∶7∶2∶1）为展开剂[1-2]，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。实验结果显示该方法分离效果好，斑点清晰，且阴性样品无干扰，结果见图1。

图1 黄连的薄层色谱图（紫外光365 nm）

2.1.2 三七

取本品15粒，加二氯甲烷50 mL，溶解，滤过，弃去滤液，残渣挥干溶剂，加适量水浸润并搅匀，再加水饱和正丁醇20 mL，超声提取30 min，滤过，残渣再超声提取2次，合并3次滤液并蒸干，残渣加2 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取三七皂苷R1对照品，人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品，分别加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10，下层）为展开剂[3-4]，展开，晾干溶剂，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置紫外灯（365 nm）和日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点或斑点。实验结果显示该方法分离效果好，斑点清晰，且阴性样品无干扰，结果见图2～3。

图2 三七的薄层色谱图（紫外光365 nm）

图3 三七的薄层色谱图（日光）

2.1.3 冰片

取本品1粒，切碎，加石油醚（60～90℃）5 mL，浸泡10 min滤过，滤液作为供试品溶液。另取冰片对照品，加甲醇制成每1 mL含0.02 g的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲苯（3∶17）为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰[5]。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。实验结果显示该方法分离效果好，斑点清晰，且阴性样品无干扰，结果见图4。

图4 冰片的薄层色谱图（日光）

2.1.4 血竭

取本品1粒，切碎，加二氯甲烷5 mL，溶解，滤过，作为供试品溶液。另取血竭对照药材0.05 g，加二氯甲烷5 mL，同法制成对照药材溶液。再取血竭素高氯酸盐对照品，加甲醇制成每1 mL含0.26 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇（19∶1）为展开剂[3-6]，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。实验结果显示该方法分离效果好，斑点清晰，且阴性样品无干扰，结果见图5。

图5 血竭的薄层色谱图（紫外光365 nm）

2.2 盐酸小檗碱含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调pH至3.0）（30∶70）[7-8]；流速：1.0 mL/min；检测波长：345 nm；柱温：40℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

2.2.2.1 对照品储备液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品10.02 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液定容至刻度，作为盐酸小檗碱对照品贮备液，浓度为173.75 μg/mL。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取本品切碎，混匀，再取约1.0 g，精密称定，置100 mL量瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液95 mL，60℃水浴15 min，超声处理（功率 500 W，频率 40 kHz，温度60℃）30 min，放冷，加甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液至刻度，摇匀，冰箱（4℃）冷藏4 h，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方量比例及制备工艺，取缺黄连的其他药材制备阴性样品。精密称取阴性样品，按照“2.2.2.2”项下的方法制备阴性样品溶液。

2.2.3 专属性试验

分别取上述溶液和甲醇-盐酸 （100∶1）溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，见图6。结果显示，复方痔疮栓样品中其他成分对盐酸小檗碱的测定无干扰。

图6 各溶液的高效液相色谱图

2.2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.2.1”项下的盐酸小檗碱对照品贮备液5 mL，置10 mL量瓶，加甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液定容至刻度，摇匀，再从中精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇-盐酸（100∶1）的溶液定容至刻度，摇匀。依此法梯度稀释，依次得到浓度为2.7148、5.4296、10.8592、21.7184、43.4367、86.8734、173.7468 μg/mL的盐酸小檗碱系列对照品溶液。将系列对照品溶液依次进样，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值（Y）对浓度（X，μg/mL）进行回归，得盐酸小檗碱的回归方程为：Y=43758X-14744（r=0.9999），盐酸小檗碱的浓度在2.7148～173.75 μg/mL范围内与其峰面积呈现良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验

精密称取盐酸小檗碱对照品13.20 mg，加甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液定容至50 mL，得盐酸小檗碱对照品贮备液，浓度为228.888 μg/mL。按“2.2.4”项下的方法配制浓度为114.444 μg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，取该溶液，按上述色谱条件分别重复进样6次，进行测定，并记录盐酸小檗碱的峰面积积分值，计算其RSD=0.57%，结果表明精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取样品（批号：20141024），按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别于0、1、2、4、6、8、10、12 h进样测定，记录峰面积积分值，计算其RSD=1.66%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验

取同一批样品（批号：20141024），按“2.2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，测定含量。结果显示，样品中盐酸小檗碱的平均含量为2.6603 mg/g，RSD=1.52%，表明重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：201503183）约0.5 g，共6份，分别置100 mL量瓶中，再分别精密加入盐酸小檗碱对照品贮备液（0.1673 mg/mL）各5 mL，按“2.2.2.2”项下方法制备即得。精密吸取上述供试液10 μL注入色谱仪，测定含量，结果平均回收率为102.43%，RSD=0.34%（n=6）。见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.2.9 含量测定

取不同批次复方痔疮栓，分别按“2.2.2.2”项下方法处理制剂样品并进行测定，计算每批制剂样品中盐酸小檗碱的含量。见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 展开剂的选择

该制剂原质量标准中黄连的薄层鉴别采用了“苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）”为展开体系，试剂苯因毒性较大已经在《中国药典》中被禁止使用；本研究根据文献和实验筛选，优化展开系统为“正丁醇-甲醇-冰醋酸-水（14∶7∶2∶1）”[9-12]，能够将来自黄连的四种生物碱类成分同板鉴别，且阴性无干扰。

3.2 提取方法的选择

本研究在供试品溶液制备中选择了甲醇-盐酸（100∶1）作为提取溶剂，并先后考察了溶剂用量和提取时间，结果表明1.0 g制剂以100 mL溶剂60℃水浴15 min，超声处理30 min，盐酸小檗碱的提取效率最高；同时，由于栓剂基质对测定的影响，实验中还考察了栓剂基质的分离方法，结果表明将样品提取液采用“4℃冷藏4 h”的处理过程能够最大限度地使栓剂基质混合脂肪酸甘油脂与待测成分分离，从而减少其对于测定结果的影响以及对色谱柱的污染。

3.3 流动相的选择

研究曾选用乙腈-0.2%磷酸（每1 L加三乙胺1 mL）[13-15]作为流动相，结果目标峰与杂质分离度不佳；改用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调pH=3.0）[7-8]后待测成分与杂质实现了基线分离，并获得了较好的峰形和较高的理论塔板数。

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Study on the methods of qualitative identification and quantitative analysis of Compound Zhichuang Suppository

XU Benshan LEI Ning MA Ping CHEN Jingjie WU Cheng TONG Weihang
Department of Pharmacy,the Second Artillery General Hospital of Chinese People's Liberation Army,Beijing 100088, China

Objective To improve the quality standard of Compound Zhichuang Suppository,so as to ensure the quality of preparations.Methods Rhizoma Coptidis,Radiχ Notoginseng,Borneolum Syntheticum and Sanguis Draconis of Compound Zhichuang Suppository were identified by thin layer chromatography.The high performance liquid chromatography method was used to determine the content of berberine hydrochloride.Chromatographic condition:the chromatographic column was WondaSil C18-WR(4.6 mm×250 mm,5 μm),the mobile phase was acetonitrile-0.05 mol/L NaH2PO4solution(pH was adjusted to 3.0 by phosphoric acid)(30∶70).The flow rate was 1.0 mL/min,the column temperature was at 40℃and the detection wavelength was 345 nm.Results The thin layer chromatography had clear spots and it was well-separated without negative interference.The good linear correlation existed within the range of 2.7148-173.7468 μg/mL for berberine hydrochloride(r=0.9999,n=6)and the average recovery was 102.43%,with RSD of 0.34%(n=6).Conclusion The method is simple and accurate,which can be used for qualitative identification and quantitative analysis of Compound Zhichuang Suppository.

Compound Zhichuang Suppository;Berberine hydrochloride;Thin layer chromatography;High performance liquid chromatography;Qualitative identification;Quantitative analysis

R284.1

A

1673-7210（2015）11（c）-0008-05

2015-07-21本文编辑：张瑜杰）

全军医疗机构制剂标准提高科研专项课题面上项目（13ZJZ19-2）。

雷宁（1978-），女，博士，副主任药师；研究方向：天然药物的药效物质基础及质量标准。