单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植对再生障碍性贫血的临床观察及其促进造血机制的初步疗效研究

徐丽昕 闫 蓓 张旭辉 吴亚妹 李晓红 曹永彬 吴晓雄

单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植对再生障碍性贫血的临床观察及其促进造血机制的初步疗效研究

徐丽昕 闫 蓓 张旭辉 吴亚妹 李晓红 曹永彬 吴晓雄

目的探讨单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗再生障碍性贫血的初步疗效。方法选取2012年12月至2014年12月间我院收治的5例再生障碍性贫血患者为研究对象，给予患者单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗。术后观察患者回输的MNC、CD34+细胞数，GVHD发生率，血象恢复时间，SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO、IL-11、SCF等细胞因子变化情况，以及骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白改善情况，并统计并发症发生情况。结果5例患者均获得造血重建，移植后血小板恢复时间平均为15 d，血细胞恢复时间平均为10.4 d。3例患者发生Ⅲ度aGVHD，3例患者发生局限性cGVHD，经治疗后均好转，4例患者恢复良好，1例患者术后73 d死于真菌性肺炎。移植后患者血清SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO以及SCF水平明显改善（P＜0.05）；治疗后骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白明显高于治疗前（P＜0.05）；1例患者EB病毒血症，2例出血性膀胱炎，2例真菌性肺炎。结论单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗再生障碍性贫血疗效显著，能够明显改善患者骨髓造血微环境，安全且并发症低，值得进一步开展临床应用研究。

单倍体造血干细胞脐带间充质干细胞移植再生障碍性贫血

再生障碍性贫血（SAA）是一组由多种病因所致的骨髓功能障碍，主要表现为全血细胞减少[1]，发病机制尚不明了，可能与化学药物、放射线、病毒感染及遗传因素有关。多见于青壮年。治疗方法包括病因治疗、支持疗法和促进骨髓造血功能恢复的各种措施[2]。单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗再生障碍性贫血属于先进技术，仅有少数几个治疗中心进行尝试[3]。为了探讨本治疗方法的初步疗效及安全性，我院在2012年12月至2014年12月，对5例再生障碍性贫血患者进行治疗。治疗前，患者及家属均知情同意，治疗方案获医院伦理委员会批准。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2012年12月至2014年12月间我院收治的5例再生障碍性贫血患者为研究对象，其中男性2例，女性3例；年龄4～39岁，平均年龄13.4岁；病程4～48个月，平均14个月；4例患者为重型再生障碍性贫血，1例患者为先天性纯红再生障碍性贫血。供者年龄12～41岁，平均年龄30.6岁；4例为亲缘供者，1例为非亲缘供者；所有供者体格检查证实均符合造血干细胞移植供者捐献的标准，自愿提供干细胞，并签署造血干细胞捐献知情同意书。脐带间充质干细胞来源于北京市脐血库。

1.2 治疗方法

重组人粒细胞集落刺激因子皮下注射5～6 d，第5天采集骨髓200～800 mL，MNC（2～3）×108cells/Kg，第6～7天以CS3000plus（Baxter公司）分离外周血干细胞，每次循环血量8～10 L，终体积为0.2 L，输入MNC 5×108cells/Kg，CD34+细胞数（2.0～4.0）×106 cells/Kg。

患者移植预处理选用福达拉滨+兔抗人胸腺细胞球蛋白+环磷酰胺为基础的方案，4例患者为CTX (700/m2)+Flud+ATG，1例患者因骨髓存在灶性增生活跃，在该方案基础上加用减量BU（1.1mg/Kg·6h）2 d。0 d回输供者骨髓，回输前6 h输注脐带MSC 2 U。+1 d、+2 d输供者造血干细胞，输注前给予碳酸氢钠碱化、地塞米松、异丙嗪等药物。输供者造血干细胞同时，给予抗炎、保肝等治疗，并预防并发症。

采用联合免疫抑制方案，即环孢素+霉酚酸酯+巴利昔单克隆抗体（CD25单克隆抗体）预防急性移植物抗宿主病。

1.3 观察指标

从移植前开始至移植后+5 d、+10 d、+15 d、+20 d留取患者外周血标本，用ELISA方法检测SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO和SCF值的变化。Western boltting法分析治疗前后骨髓有核细胞ERK蛋白表达及磷酸化水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 治疗效果

5例患者回输的MNC平均为11.27×108cells/Kg，CD34+细胞数4.0×106cells/Kg。5例患者均获得造血重建，移植后1个月复查，4例患者嵌合体均为100%供者嵌合，1例患者为90%供者嵌合，5例患者移植后血小板恢复时间平均为15 d，血细胞恢复时间平均为10.4 d。3例患者发生Ⅲ度aGVHD，3例患者发生局限性cGVHD，经治疗后均好转。4例患者恢复良好，1例患者73 d死于真菌性肺炎。

2.2 相关细胞因子变化情况

移植5 d后患者血清SDF-1α、TPO和SCF水平显著高于移植前，移植20 d后患者血清G-CSF、IL-6以及GM-CSF水平显著低于移植前（P＜0.05）（表1）。

2.3 治疗前后骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白的表达情况比较

治疗后骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白（0.63±0.08）明显高于治疗前（0.42±0.06）（P＜0.05）。

2.4 并发症发生情况

5例患者移植期间均出现不同程度的恶心、呕吐等不良反应，给予对症、支持治疗后好转。1例患者EB病毒血症，2例出血性膀胱炎，2例真菌性肺炎。

表1 患者移植前后相关生长因子变化情况Table1 The changes of related growth factors before and after transplantation

3 讨论

再生障碍性贫血是血液科危重症之一，起病急，进展快，死亡率高。Allo-HSCT是治疗再生障碍性贫血的首先方法，但约仅有30%的患者能找到HLA相同的供者，而单倍型相合的亲缘供者较易找到[4]。

本研究采用单倍体造血干细胞，联合脐带间充质干细胞移植，治疗再生障碍性贫血，初步结果显示，5例患者均获造血重建，血象恢复较快，并发症较低，疗效满意。血清相关细胞因子水平得到显著改善。本方法采用单倍体造血干细胞，能够迅速恢复造血，其中的大量基质细胞还能够调节免疫功能，降低GVHD的发生率。脐带间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，存在于多种组织内，有多种细胞因子能够促进干细胞植入免疫调控和自我复制，且免疫源性非常低[5]。单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植，还可显著加快移植后的造血重建。此外，再生障碍性贫血是骨髓衰竭性疾病的一种，骨髓衰竭性疾病还包括AA-PNH、MDS，临床一般性治疗效果差[6]。以后有望将本方法延展至所有骨髓衰竭性疾病的治疗，提高该类疾病的疗效。本研究还为进一步开展联合UC-MSCs的Haplo-SCT治疗其他恶性血液病提供了临床和实验依据。

研究证实，骨髓造血微环境的损伤及造血细胞因子分泌紊乱，是导致再生障碍性贫血发生的重要原因；细胞免疫，尤其是T淋巴细胞质和量的变化也起了重要的作用[7]。人体SDF-1/CXCR-4介导的相关归巢效应能加速造血重建。此外，SDF-1/CXCR-4通过产生大量的细胞外基质分子，介导与骨髓基质的黏附，使归巢的HSC稳定黏附于骨髓微环境，进而改善造血微环境。白细胞介素-6是骨髓基质细胞所分泌的多种细胞因子中的一种，在免疫应答、急性期反应、造血调节等过程中都发挥重要作用[8]。近期研究发现，UC-MSCs的联合移植可改善骨髓造血微环境，促进造血干细胞的植入[9-10]。本研究也发现移植后患者的造血相关细胞因子血清水平得到明显改善，治疗后骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白明显高于治疗前，ERK1/2蛋白参与造血干/祖细胞增殖与分化，磷酸化ERK1/2蛋白为其功能的活性状态，磷酸化程度增加则促进造血干/祖细胞增殖，磷酸化ERK1/2蛋白水平的增加，提示造血干/祖细胞增殖与分化能力增加，造血微环境改善。但受限于时间及病例数，其促进造血的机制尚有待于深入研究。

综上所述，单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植，治疗再生障碍性贫血疗效显著，能够明显改善患者骨髓造血微环境，安全且并发症低，值得临床进一步开展应用研究。

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[2]张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M],3版.北京:科学出版社，2007:232-235.

[3]徐丽昕，刘周阳，吴亚妹，等.单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血II型的临床观察[J].中国实验血液学杂志,2014,22(3):774-778.

[4]Young ME,Potter V,Kulasekararaj AG,et al.Haematopoietic stem cell transplantation for acquired aplastic anaemia[J].Curr Opin Hematol,2013,20(6):515-520.

[5]徐丽昕，曹永彬，王志红，等.单倍体相合造血干细胞联合脐带血间充质干细胞移植治疗急性重型再生障碍性贫血的疗效观察[J].中国实验血液学杂志,2011,19(5):1241-1245.

[6]Xu LP,Liu KY,Liu DH,et al.A novel protocol for haploidentical hematopoietic SCT without vitro T-cell depletion in the treatment of severe acquired aplastic anemia[J].Bone Marrow Transplant, 2012,47(12):1507-1512.

[7]Wu Y,Wang Z,Cao Y,et al.Cotransplantation of haploidentical hematopoietic and umbilical cord mesenchymal stem cells with a myeloablative regimen for refractory/relapsed hematologic malignancy [J].Ann Hematol,2013,92（12）：1675-1684.

[8]徐丽昕，曹永彬，刘周阳，等.两种第三方细胞联合单倍体相合造血干细胞移植治疗慢性再生障碍性贫血1例[J].中国实验血液学杂志，2013,21(6):1522-1525.

[9]Wu Y,Cao Y,Li X,et al.Cotransplantation of haploidentical hematopoietic and umbilical cord mesenchymal stem cells for severe aplastic anemia：successful engraftment and mild GVHD [J].Stem Cell Res,2014,12(1):132-138.

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Clinical Effect of Transplantation of Haploid Hematopoietic Stem Cells Combined with Cord Mesenchymal Stem Cells in Treating Aplastic Anemia

XU Lixin1,YAN Bei1,ZHANG Xuhui2,WU Yamei1,LI Xiaohong1,CAO Yongbin1,WU Xiaoxiong1.1 Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital,Beijing 100048,China; 2 Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,China.Corresponding author:WU Xiaoxiong(E-mail: xiongwuxiao@sohu.com).

ObjectiveTo investigate the clinical effect of transplantation of haploid hematopoietic stem cells combined with cord mesenchymal stem cells in the treatment of aplastic anemia.MethodsFrom December 2012 to December 2014, 5 cases with aplastic anemia were treated with haploid hematopoietic stem cells combined with cord mesenchymal stem cells transplantation.The MNC,CD34+cells,GVHD incidence,blood recovery time,changes of related growth factors(like SDF-1α,G-CSF,IL-6,GM-CSF,TPO,SCF),the improvement of bone marrow nucleated cells protein phosphorylation ERK1/2 and complications were all observed.ResultsFive patients obtained hematopoietic reconstitution with MNC of 11.27×108cells/Kg and CD34+of 4.0×106cells/Kg.The average platelet recovery time was 15 days and the average recovery time of blood cells was 10.4 days.aGVHD of stage III was observed in 3 patients,localized cGVHD was observed in 3 patients,and they were all improved after treatment.Four patients recovered well,one patient died of fungal pneumonia 73 days after treatment.After transplantation,serum SDF-1α,G-CSF,IL-6,GM-CSF,TPO and SCF were significantly improved(P＜0.05), the expression of phosphorylation ERK1/2 protein of bone marrow nucleated cells was significantly increased(P＜0.05).Onecase of EB viremia,two cases of hemorrhagic cystitis and two cases of fungal pneumonia were observed.Conclusion Haploid hematopoietic stem cells combined with cord mesenchymal stem cell transplantation is effective in the treatment of aplastic anemia,it can significantly improve the bone marrow microenvironment of patients with higher safety and lower complication.It is worthy of further clinical application.

Haploid hematopoietic stem cells;Umbilical cord mesenchymal stem cells;Transplantation;Aplastic anemia

R556+.5

A

1673-0364（2015）05-0292-03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.05.002

2015年7月20日；

2015年9月9日）

总医院科研扶持基金（2012FC-TSYS-4007）。

100039北京市解放军总医院第一附属医院血液科（徐丽昕，闫蓓，吴亚妹，李晓红，曹永彬，吴晓雄）；100850北京市军事医学科学院二所（张旭辉）。

吴晓雄（E-mail：xiongwuxiao@sohu.com）。