新型复合纤维蛋白胶的磷酸钙骨水泥的生物安全性研究

丁 超 李 奇 林荔军 孙永建

新型复合纤维蛋白胶的磷酸钙骨水泥的生物安全性研究

丁 超 李 奇 林荔军 孙永建

目的研究新型复合纤维蛋白胶的磷酸钙骨水泥的生物相容性和生物安全性，探讨其用于临床修复骨缺损的可行性。方法制备新型复合纤维蛋白胶的磷酸钙骨水泥，获取材料浸提液。选择急性毒性试验、溶血试验、微核试验、细胞毒性试验，对新型复合人工骨材料进行生物相容性和安全性评价。结果该磷酸钙骨水泥材料浸提液未引起小鼠急性毒性反应；各实验组肉眼下未见明显溶血反应，溶血率＜5%；微核实验显示，各实验组微核率与阴性对照组无差别（P＞0.05）；浸提液对小鼠MC3T3成骨细胞的生长分化无明显影响，细胞毒性分级为Ⅰ级。结论新型复合纤维蛋白胶的磷酸钙人工骨材料具有良好的生物相容性和生物安全性。

磷酸钙骨水泥纤维蛋白胶生物相容性生物安全性

随着与老龄化、户外运动、交通事故等有关的骨损伤的增加，骨骼的重建及骨缺损的修复日渐成为骨科临床的一个重要难题[1]。替代骨缺损的生物材料众多，但各有优缺点。目前的治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植、生物材料填充等，治疗效果和模式都不很理想。磷酸钙骨水泥（CPBC）具有自固化特点，可以任意塑形，有良好的生物相容性、可降解性和骨传导性等。目前，CPBC已获准进行临床试验，但在临床应用中面临问题，由于某些情况下手术部位难以彻底止血，骨水泥注入后原位固化时需要具有合适的凝固时间和良好的抗稀散性能[2-3]；另外，CPBC具有易脆性和相对较低的抗压强度，难以用于负重骨、段性骨缺损的治疗[4-5]。因此，本实验针对这些缺点，研制了具有良好物理学性能的复合纤维蛋白胶（FG）的β－TCP/MCPM复合人工骨材料，研究其生物相容性和安全性。

1 材料和方法

1.1 实验试剂与材料

FG（广州倍绣生物技术有限公司，分为生物胶主体、主体溶解液、催化剂及催化剂溶解液部分），β-磷酸三钙（上海瑞邦生物材料有限公司），磷酸二氢钙（东泰化工赠）。

1.2 磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶复合人工骨的制备

将β-TCP和MCPM按3∶1配比充分混合后，与500 mmol/L柠檬酸溶液按固液比1∶0.3的重量体积比混合，再用双腔推液器同时加入相同体积的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液。二者按凝固后体积比为2∶1的比例均匀混合。

1.3 材料浸提液的获取

取CPBC骨水泥试样置于细胞培养瓶，于高压蒸汽灭菌锅中进行30 min灭菌处理。将生理盐水按0.2 g/mL加入培养瓶，置于37℃恒温箱中浸提72 h，过滤除菌后分装，密封，4℃冰箱保存备用。将块状CPBC按0.2 g/mL的量置于新配置的DMEM/F-12培养液中，37℃恒温箱中浸提72 h，过滤除菌分装，密封，4℃冰箱保存备用。

1.4 急性毒性实验

取体质量（20±2）g的小鼠20只，分为材料浸提液组和生理盐水组，每组雌、雄各5只，分别静脉注射浸提液原液和生理盐水，取上述磷酸钙骨水泥材料浸提液和生理盐水浸提液每只注射1 mL。注射24 h、48 h和72 h后小鼠称重，并观察小鼠。

1.5 溶血试验

将新鲜抗凝人血用生理盐水稀释成2%人血悬液。在不同的试管中分别加入材料浸提液、50%材料浸提液、10%材料浸提液、生理盐水（阴性对照）和双蒸水（阳性对照），每组各5份，每管2 mL。再在每管分别加入2%新鲜健康人血悬液2 mL，37℃水浴1 h，肉眼观察有无溶血。1 000 r/min离心5 min。取上清液1 mL，加入0.1%Na2CO3溶液4 mL，在752型分光光度计540 nm处测定各样本光密度并计算溶血率。溶血率=（样品吸光度-阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度-阴性对照吸光度）。

1.6 微核试验

取健康昆明种小鼠，体质量25～30 g，雌雄各半，随机分为5组，每组各5只。其中3组分别腹腔注射不同剂量的材料浸提液（0.1、0.2、0.4 mL），另2组为阴性对照组（生理盐水）和阳性对照组（环磷酰胺100 m/g）。采用4次给药法，每次间隔24 h，于第4次给药后6 h处死动物。取股骨髓制片，瑞特氏（Wright）染色。选择细胞分布均匀、完整、着色适当的区域在油镜下计数，每只动物观察1 000个嗜多染红细胞，计数其中含微核的嗜多染红细胞数，计算微核细胞率。

1.7 细胞毒性实验

取MC3T3成骨细胞（南方医科大学解剖实验室赠），经复苏、传代后，于对数生长期胰酶消化，制成密度为5×104cells/mL的细胞悬液，接种于96孔板，细胞贴壁后弃培养液，加入不同浓度的DMEM/ F-12材料浸提液（浸提液组、50%浸提液组、10%浸提液组），单纯培养液组为阴性对照，含0.64%苯酚的培养液组为阳性对照。置于37℃、5%CO2培养箱中培养，分别于24、48、72 h后取出，每孔加入0.5% MTT 20 μL，继续培养4 h。弃培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，震荡5 min，酶标仪490 nm下测定每孔OD值。计算细胞相对增殖率，RGR=（试验组OD值-空白OD值）/（阴性对照组OD值-空白OD值），并进行细胞毒性分级。RGR≥100%为0级；75%～99%为Ⅰ级；50%～74%为Ⅱ级；25%～49%为Ⅲ级；1%24%为Ⅳ级；0为Ⅴ级。

2 结果

2.1 全身急性毒性试验分析

全身急性毒性试验分析显示，浸提液组小鼠的平均体重在注射24、48、72 h后的变化与生理盐水组基本一致，并且小鼠在注射浸提液后也未出现死亡或昏迷、呼吸抑制、呼吸困难、四肢活动受限等中毒反应，表明该复合人工骨材料没有急性全身毒性（表1）。

2.2 溶血试验

溶血试验肉眼下观察示，各实验组和阴性对照组无明显溶血，阳性对照组可见有明显溶血，溶血率检测示各组溶血率均未超过5%，达到《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》（表2）。

表2 各组溶血率（n=5）Table2 Hemolytic rate in each group(n=5)

2.3 微核试验

各实验组动物股骨髓嗜多染红细胞的微核率经χ2检验，与阴性对照组无显著性差异（P＞0.05），阴性对照组与阳性对照组差异显著（P＜0.05）。说明新型复合人工骨材料的浸提液无细胞遗传毒性作用（表3）。

表3 微核试验结果Table3 The results of micronucleus test

2.4 细胞毒性试验

细胞毒性试验显示，各实验组和阴性对照组小鼠MC3T3成骨细胞生长分化良好，细胞密度较高，贴壁生长，多为长梭形和多角形，并见圆形分裂状态细胞，阳性对照组细胞出现生长分化停止，细胞缩小变类圆形，出现较多漂浮状死细胞（图1）。加入MTT后成活的MC3T3成骨细胞中形成结晶（图2）。酶标仪测试各组吸光度值及相对增殖率值，结果显示各实验组对MC3T3成骨细胞的细胞毒性均为Ⅰ级，符合《生物材料和医疗器材生物学评价技术要求》的规定（表4）。

图1 小鼠MC3T3成骨细胞形态观察（200×）Fig.1 Morphological observation of mouse MC3T3 osteoblasts(200×)

图2 加入MTT后MC3T3细胞形态（200×）Fig.2 Morphology of MC3T3 after MTT added(200×)

表4 细胞毒性试验结果（n=5）Table4 The results of cell toxicity test(n=5)

3 讨论

磷酸钙骨水泥作为骨的替代材料已有较长的历史，已有部分产品用于临床修复骨缺损[6-8]。生物材料在具有合理的物理性能的同时，还需进行生物相容性的评价。完整的生物学评价应包括初级急性毒性筛选、动物体内应用和临床试用3级试验，以保证使用安全。如何快速准确地评价材料的生物相容性和生物安全性，对于研制新材料和缩短研制周期起着重要的作用[9]。生物材料的评价方法有多种，本研究的材料生物学评价主要参考了国际标准化组织（ISO）颁布的ISO10993系列标准，国家医药管理局颁布的GB/T16886系列，以及1982年美国国家标准学会和牙科协会（ANSI/ADA）公布的评价生物相容性实验标准草案，选择急性毒性试验、溶血试验、微核试验、细胞毒性试验对新型复合纤维蛋白胶的磷酸钙人工骨材料进行生物相容性和安全性评价。

生物材料中一些易溶出物质是引起炎症的主要原因[10]。为研究这些溶出物的细胞毒性，可采用浸提液法。该法是将试样投入培养液或蒸馏水中，在适当条件下进行浸泡，制备出含有溶出物的浸泡液，再将浸提液加在含有细胞的培养皿继续培养，观察溶出物对细胞的影响[11]。本研究通过观察材料浸提液对细胞及动物的影响，评价材料的生物安全性。对于体外血液相容性评价，需选用合理的血液与材料接触模型、敏感而又特异的检测指标，而目前对于血液材料接触模型、检测指标及方法尚无明确的标准[12]。本研究急性毒性实验结果显示，实验组与阴性对照组无明显差异，说明该材料浸提液没有对小鼠产生明显的毒性反应。溶血率检测示各组溶血率均未超过5%，达到标准要求，符合上海市非直接接触血液的医用生物材料生物性能测试试行规格中规定的标准。根据ISO以及我国GB/T16886中有关生物材料生物学评价的要求中推荐首先使用短期遗传毒性试验做筛选，规定短期遗传毒性试验阴性者可不做致癌试验。因此，本实验选择微核实验来评价CPBC的遗传毒性，结果示实验组微核率与阴性对照组差异不显著，阴性对照组与阳性对照组差异显著。说明该复合人工骨材料的浸提液无细胞遗传毒性作用。体外细胞实验是初级急性毒性筛选的一个重要方面，是一种快速、简便、重复性好又廉价的检测材料生物相容性方法，在评价材料生物相容性方面的地位已得到公认[13]。细胞毒性试验的方法有多种，本实验采用ISO 10993及GB/T16886中推荐的-四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初应用于免疫学领域，近年来应用于生物相容性评价中[14-15]。该法简便迅速，不接触同位素，而敏感性与同位素法接近。细胞毒性试验的结果评判，需将细胞相对增殖率换算成毒性分级，规定细胞毒性≤Ⅰ级为合格。本研究结果显示，各实验组的细胞毒性均为Ⅰ级，符合生物安全性及相容性要求。

实验结果显示该复合材料具有良好的生物相容性和生物安全性，达到生物相容性和生物安全性要求，基本满足作为注射型人工骨材料临床应用的安全性需要，也为进一步进行动物体内试验提供了理论基础。

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Biocompatibility and Biosafety Research of New Compound of Fibrin Glue and Calcium Phosphate Bone Cement

DING Chao,LI Qi,LIN Lijun,SUN Yongjian.The Fifth Affiliated Hospital Orthopaedics,Southern Medical University, Conghua 510900,China.Corresponding author:DING Chao(E-mail:nfwydingchao@163.com)

ObjectiveTo explore the biocompatibility and biosafety of new compound of fibrin glue and calcium phosphate bone cement,and to investigate the clinical feasibility for bone reconstruction.MethodsThe new compound of fibrin glue and calcium phosphate bone cement was prepared and the extract liquid was obtained.The acute toxicity test, hemolysis test,micronucleus test,the cytotoxic test were used for the biocompatibility and biosafety evaluation of the new compound.ResultsThe CPBC extract liquid did not cause acute toxicity in mice;No hemolytic reaction was observed in experimental groups by visual inspection and the hemolytic rate was less than 5%;Micronucleus test showed no significant differences between experimental group and negative control group;The extract liquid had no significant impact on growth and differentiation of mice MC3T3 osteoblasts,and the cell toxicity classification was class I.ConclusionThe new compound of fibrin glue and calcium phosphate bone cement have good biocompatibility and biosafety.

Calcium phosphate bone cement;Fibrin glue;Biocompatibility;Biosafety

H,Nakamura M.A study on

tandard for cytotoxicity assay of biomaterials[J].Biomed Mater Eng,1994,4 (4):327-332.

R318.08

A

1673－0364（2015）05－0301－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.05.004

2015年4月11日；

2015年6月7日）

510900广东省从化市南方医科大学第五附属医院骨科。

丁超（E-mail：nfwydingchao@163.com）。