Sox9诱导人脐血干细胞向软骨细胞分化的实验研究

张 军 张耀明 王正辉 张 青 罗花南 郑国玺 侯 瑾 王波涛 杨叶叶 赵小燕 史艳霞

·论著·

Sox9诱导人脐血干细胞向软骨细胞分化的实验研究

张 军 张耀明 王正辉 张 青 罗花南 郑国玺 侯 瑾 王波涛 杨叶叶 赵小燕 史艳霞

目的探讨Sox9基因对脐血干细胞向软骨细胞分化的影响。方法体外分离培养人脐血干细胞，采用脂质体转染Sox9载体质粒，观察转染后细胞形态的变化，免疫组化染色观察collagenⅡ、aggrecan的表达，RT-PCR检测collagenⅠ、collagenⅡ、aggrecan的mRNA水平变化，Western blot检测collagenⅡ的表达变化。结果Sox9对脐血干细胞形态无明显影响，与传统方法诱导组相比，Sox9转染后可明显促进脐血干细胞向软骨细胞分化。结论Sox9对脐血干细胞的软骨分化有很强的调控作用，脐血干细胞可作为组织工程软骨一种良好的种子细胞。

脐血干细胞分化Sox9基因

软骨自身修复能力非常有限，组织工程软骨构建为修复软骨缺损提供了一条新途径。但是，软骨细胞在体外培养过程中存在老化、去分化现象，随着传代次数的增加，细胞逐渐向成纤维细胞分化。因此，获得充足的种子细胞是组织工程软骨构建中的重点之一。间充质干细胞具有多向分化潜能，存在于脂肪、脐血、胎盘、牙髓、腺体等组织中。人脐血间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSC）具有来源丰富、易于采集和保存、无异体排斥、长期传代不变性等优点，具备多向分化潜能，可分化为软骨细胞、心肌细胞等多种细胞[1]，在组织工程领域具有广阔的应用前景。然而脐血干细胞向软骨细胞诱导分化率低，限制了其在软骨组织工程领域的应用。早期研究表明，Sox9（SRY-related high mobility group-box gene 9）在软骨分化发育过程中是一个不可或缺的调控因子[2-3]。因此，本研究尝试将脐血干细胞过表达Sox9，与传统诱导方法进行比较，观察其是否能促进脐血干细胞向软骨细胞分化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

高糖DMEM培养基、胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）；透明质酸酶、Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）；FBS（Invitrogen公司，美国）；Ⅱ型胶原一抗（小鼠抗人，Neomarker公司，美国）；Aggrecan单克隆抗体（羊抗人，Santa Cruz公司，美国）；Sox9质粒（Gene Copoeia公司，美国）；RT-PCR mix（Toyoboco公司，日本）；CO2孵箱（Thermo公司，美国）；荧光显微镜（Nikon公司，日本）。

1.2 脐血干细胞的分离培养

本研究经西安交通大学伦理委员会批准。脐血采集后24 h内处理，将脐血用PBS以1∶1稀释，室温下静置20 min或至血浆与红细胞界面形成后，吸取血浆层，2 000 r/min离心5 min，弃上清，用5 mL α-MEM悬浮细胞，按2∶1的体积比加到淋巴细胞分离液（密度1.077 g/mL）表面，使两者间形成一清晰界面。2 000 r/min离心20 min，离心后轻轻吸取悬于分离液面的白膜层，D-Hank's洗涤，1 000 r/min离心4 min。用5 mL α-MEM培养基重悬细胞，获得hUCMSCs悬液。按1×106cells/cm2的密度将上述细胞悬液接种于25 cm2的培养瓶，37℃培养箱中培养；72 h后更换培养液，之后2 d更换1次培养基。鉴定参照文献[4]的方法。

1.3 转染Sox9质粒

将脐血干细胞以5×105的密度接种于6孔板内，细胞长至80%～90%时转染质粒。参照LipofectamineTM2000说明书进行操作。

1.4 脐血干细胞向软骨细胞诱导分化

取第3代hUC-MSCs进行诱导分化。实验分为3组：阴性对照组（未处理组），Sox9转染组，传统方法诱导组（高糖DMEM培养基中加入5%胎牛血清，100 nM地塞米松，50 μg/mL抗坏血酸，10 ng/mL TGF-β，10 ng/mL IGF-Ⅰ，1×ITS+）；诱导后4%多聚甲醛固定，常规切片，甲苯胺蓝染色，光镜观察。

1.5 RT-PCR检测基因的表达

按照试剂盒说明提取总RNA，使用cDNA逆转录反应试剂盒进行逆转录，将反转录的cDNA按照以下体系（25 μL体系）进行PCR扩增。

β-actin引物序列：正义链5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'，反义链5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'；Aggrecan引物序列：5'-GCAGTCTTCCAACCCAA-3'，反义链5'-ACATCT CCAGCCTCCTTA-3'；CollagenⅠ引物序列：5'-CTTGGTCTCGTCACAGATCA-3'，反义链5'-CTTTTAACGGAGGATGTGCTATTTGGC-3'；CollagenⅡ引物序列：5'-GGAGCAGCAAGAGCAAGGAGAAG-3'，反义链5'-TGGACAGCAGGCGTAGGAAGG-3'；Sox9引物序列：5'-GAACGCACATCAAGACGGAG-3'，反义链5'-TCTCGTTGATTTCGCTGCTC-3'。反应条件：94℃2 min，94℃30 sec，53℃30 sec，72℃30 sec，循环35次。反应产物于1%凝胶中进行电泳。凝胶成像系统分析各电泳条带的吸光度，得出mRNA的相对表达量。

1.6 免疫学检测

细胞贴壁后4%多聚甲醛固定，Triton室温下浸泡25 min，0.01 M PBS洗3次，每次5 min；滴加一滴工作用血清（试剂A），常温孵育15 min，后分别滴加（1∶200）Ⅱ型胶原（CollagenⅡ）、aggrecan单克隆抗体50 μL，4℃冰箱过夜（＞18 h）；加入二抗稀释液稀释二抗，培养箱内孵育15 min；0.01 M PBS洗3次；显微镜下观察。

1.7 Western blot检测

诱导2周时，加入单去污细胞裂解液，4℃下以12 000 g离心3 min，取上清，用Lowry法定量蛋白，依次加入封闭液、抗CollagenⅠ、CollagenⅡ抗体、辣根过氧化物酶标记二抗，化学发光剂反应，X线曝光。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 细胞形态

转染Sox9载体48 h后细胞形态无明显变化，细胞生长良好；而传统诱导组细胞大量脱落，细胞数量减少（图1）。

2.2 脐血干细胞向软骨细胞诱导分化

甲苯胺蓝染色显示，传统方法诱导2周后可见蛋白多糖的表达，而Sox9诱导1周后即可见蛋白多糖的明显表达（图2）。

2.3 软骨细胞特异性标志物的表达

免疫组化染色证实脐血干细胞向软骨细胞的分化，经Sox9诱导1周aggrecan、collagenⅡ染色与传统诱导液诱导2周无明显差别（图3）。

采用RT-PCR检测软骨细胞特异性标志物的mRNA表达水平。脐血干细胞经Sox9载体转染后，Sox9处于较高的表达水平。蛋白多糖与Ⅱ型胶原的表达随培养时间延长表达量逐渐增强，1周时两者都有较高的表达，而Ⅰ型胶原始终未明显表达。而在传统诱导组，随着诱导时间的延长，各组基因表达量逐渐增强，2周时蛋白多糖与Ⅱ型胶原的表达与1周时Sox9组的表达无明显差别，并且Ⅰ型胶原、Sox9的表达量也逐渐增强（图4）。

Western blot结果显示，Sox9转染组1周时Ⅱ型胶原表达量很高，而传统诱导组表达量很低，两者有明显差别。2周时两组表达量无明显差别（图5）。

图1 hUCMSCs形态观察（40×）Fig.1Histological observation of hUCMSCs(40×)

图2 hUCMSCs形态观察（甲苯胺蓝染色，40×）Fig.2Histological observation of hUCMSCs (toluidine blue staining,40×)

图3 hUCMSCs免疫组化染色观察（100×）Fig.3Immunohistochemical detection of hUCMSCs(100×)

图4 RT-PCR检测不同时间点Sox9、CollagenⅠ、CollagenⅡ和蛋白多糖的基因表达Fig.4 The mRNA expression of Sox9,collagen I,collagen II and aggrecan at different time point detected by RT-PCR

图5 Western blot检测不同时间点CollagenⅡ的表达Fig.5The expression of CollagenⅡat different time point detected by Western blot

3 讨论

本研究中，我们通过梯度离心法成功从脐血中分离单核细胞，细胞形态类似成纤维细胞，通过免疫标记证实为脐血干细胞。加入传统诱导液后，细胞大量脱落，数量明显减少，而Sox9转染组细胞形态无明显变化，细胞生长良好。

既往应用基因技术诱导干细胞向软骨细胞分化的研究，主要聚焦于TGF-Β、BMPS等外用生长因子上，软骨诱导液多含有TGF-Β、IGF等生长因子，往往导致软骨细胞表型肥大，不利于软骨细胞的诱导分化[6]；且由于生长因子位于细胞外，其浓度受环境影响，发挥的生物学效应难以控制。Sox9是细胞内的调控因子，本实验表明Sox9能诱导脐血干细胞向软骨细胞分化，同时抑制了Ⅰ型胶原的表达，进一步表明Sox9具有抑制细胞肥大的作用。

Sox9属于Sox家族[5]，主要在成软骨祖细胞及软骨细胞中表达。Akiyama等[7]报道，Sox9在小鼠肢芽间充质细胞中失活，将阻断其向软骨细胞分化，最终导致四肢软骨组织的缺乏。研究表明，Sox9可以与软骨分化过程中重要基因的启动子结合并启动其转录。这些靶基因包括col9a1、col9a2、col9a3、col2a1、col11a、aggrecan1等[8]，它们的蛋白产物为各型胶原和蛋白聚糖，是软骨细胞外基质的重要组成成分。这些胞外基质蛋白不仅对维持软骨组织的结构很重要，而且也参与调控软骨细胞分化[9]。研究表明，Sox9在干细胞体外分化为软骨细胞过程中也扮演重要角色。Furumatsu等[10]在人间充质干细胞中过表达Smad3后发现，该基因能通过激活Sox9转录活性显著促进干细胞向软骨细胞分化。本研究中，我们发现传统方法诱导组随诱导时间延长，Sox9表达逐渐增强，同时蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达也逐渐增强，我们推测诱导液可能通过增强Sox9的表达促进干细胞向软骨细胞的分化。较传统诱导组相比，Sox9转染组1周时软骨细胞特有的基因蛋白多糖、Ⅱ型胶原已明显表达，而诱导液组2周时其表达量才逐渐增强。说明Sox9转染后可明显加快脐血干细胞向软骨细胞的诱导分化。

大多数体外诱导干细胞向软骨细胞分化的实验，采用“三维”培养模式，是为了更好地模拟体内软骨形成过程中细胞聚集的过程，但该方法的细胞团中心由于营养、氧气等不足，限制了细胞或组织的增殖。目前单层培养也有一定的局限性，比如原代软骨细胞在单层培养条件下会失去软骨细胞表型。但本实验发现，Sox9转染的脐血干细胞在单层培养条件下显示出较强的软骨分化能力，说明Sox9基因对脐血干细胞软骨分化有很强的调控作用。

综上所述，脐血干细胞具有良好的软骨分化潜能，较传统诱导方法相比，Sox9诱导可明显加快脐血干细胞向软骨细胞诱导分化，而脐血干细胞可作为组织工程软骨构建的良好的种子细胞。

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Chondrogenic Differentiation of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Induced by Sox9

ZHANG Jun1,ZHANG Yaoming2,WANG Zhenghui3,ZHANG Qing3,LUO Huanan3,ZHENG Guoxi3,HOU Jin3,WANG Botao3,YANG Yeye3,ZHAO Xiaoyan3,SHI Yanxia3.

1 Department of Otolaryngology,the Affiliated Hospital of Yan'an University,Yan'a 717100,China;
2 Department of Otolaryngology,the People's Hospital of Yan Chang County,Yan'an 717100,China;
3 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,The Second Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004, China.Corresponding author:WANG Zhenghui(E-mail:ehui4298@163.com).

ObjectiveTo investigate the effect of Sox9 gene on inducing the chondrogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells.MethodsHuman umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs)were obtained by microdissection and digestion,and cultured in monolayer.The growth velocity and morphological changes of hUCMSCs were observed after Sox9 transfection.The expression of collagenⅡand aggrecan were detected by immunohistochemistry.The mRNA expression of collagenⅠ,collagenⅡand aggrecan were detected by RT-PCR,and collagenⅡcontent was detected by western blot.ResultsThe Sox9 gene had no significant effect on the morphology of hUCMSCs,and significantly accelerated the differentiation of hUCMSCs to chondrocytes compared with the traditional induction group.ConclusionSox9 gene can regulate the differentiation of hUCMSCs,and hUCMSCs can be used as seed cells for cartilage tissue engineering.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Differentiation;SRY-related high mobility group-box gene 9

Q813.1+1

A

1673－0364（2015）04－0221－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.001

2015年3月29日；

2015年5月5日）

国家自然科学基金资助项目（81000416）；中央高校基本科研业务费专项资金（西安交通大学国际合作类）；西安交通大学第二附属医院重点项目基金。

717100陕西省延安市延安大学附属医院耳鼻喉科二病区（张军）；717100陕西省延安市延长县人民医院耳鼻喉科（张耀明）；710004陕西省西安市西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉-头颈外科（王正辉，张青，罗花南，郑国玺，侯瑾，王波涛，杨叶叶，赵小燕，史艳霞）。

王正辉（E-mail：ehui4298@163.com）。