小黑药总黄酮抗氧化性研究

2015-11-27杨涛韩磊冯国强宋培培刘品华

现代农业科技 2015年17期

杨涛++韩磊++冯国强++宋培培++刘品华

摘要研究小黑药全株总黄酮的含量及提取分离，并用Schaal烘箱法、紫外光照法测试了小黑药总黄酮和对照品BHT抗猪油氧化的能力，采用POV抑制率评价了抗氧化能力。测试了总黄酮和芦丁的还原能力、抑制超氧阴离子自由基（O2-·）的能力、DPPH自由基的清除能力、羟基自由基的清除能力。结果表明：小黑药总黄酮有良好的抗猪油氧化的作用，其抗光氧化的效果高于自动氧化；还原能力、抑制超氧阴离子自由基（O2-·）的能力、DPPH自由基的清除能力略低于芦丁，羟基自由基的清除能力高于芦丁；小黑药全株总黄酮含量为2.52%。

关键词小黑药；总黄酮；抗氧化性；过氧化值

中图分类号 TS202.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）17-0311-03

Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Sanicula astrantiifolia Wolff

YANG Tao HAN Lei FENG Guo-qiang SONG Pei-pei LIU Pin-hua*

（College of Chemistry and Chemical Engineering，Qujing Normal University，Qujing Yunnan 655011）

Abstract In this paper，the content and the optimum extraction of total flavonoid from Sanicula astrantiifolia Wolff were studied.The antioxidant activity of total flavonoids and the reference substance BHT were detected by Schaal Oven Method and UV photo-induced，and the antioxidant activity was estimated by inhibition ratio of POV.The reduction capacity of total flavonoids and Rutin，the inhibition ratio of total flavonoids to superoxide free radical（O2-·），its DPPH and hydroxyl free radicals-cavenging effect were determined.The results showed that：The total flavonoids from Sanicula astrantiifolia Wolff showed significant inhibitory effects on the oxidation of lard oil，its antioxidant effect was greater than automatic oxidation.The reduction capacity，the inhibition ratio to superoxide free radical（O2-·），its DPPH free radicals-cavenging effect were slightly lower than Rutin，and its hydroxyl free radicals-cavenging effect was greater than Rutin.The content of total flavonoid from Sanicula astrantiifolia Wolff was 2.52%.

Key words Sanicula astrantiifolia Wolff；total flavonoids；antioxidant activity；peroxide value

小黑药（Sanicula astrantiifolia Wolff）具有补肺益肾、治疗肺结核、肾虚腰痛、头昏等功效[1]。云南民间常食用小黑药，以提高免疫力和镇痛、止咳等[2]。现代食品工业中也通过小黑药改善产品质量，提高营养价值，在油脂及相关产业中得到积极应用[3-5]。笔者研究了小黑药中的总黄酮含量、抗猪油氧化效果及抗氧化性能，旨在探索小黑药中的活性成分及功能，为深入开发和利用小黑药提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。小黑药（曲靖农贸市场购买）；猪油（曲靖农贸市场购买新鲜猪肥膘，实验室火炼法提取）；芦丁（中国药品生物制品检定所）；Tris（北京西美杰科技有限公司）；1，1-二苯-2-苦基肼（日本和光纯乐工业株式会社）；二丁基羟基甲苯（BHT）（郑州超凡有限公司）；氯化亚铁（天津市风船化学试剂科技有限公司）；硫氰酸钾（天津市风船化学试剂科技有限公司）；邻苯三酚（AR）；硫酸亚铁（AR，广东台山化工厂）；水杨酸（AR，天津市化学试剂工厂）等。试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器。紫外可见分光光度计（TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司）；XPA系列光化学反应仪（南京胥江机电厂）；恒温培养箱（29SN-DP-501，天津实验仪器厂）；电子天平（AL204-IC型，梅特勒-托利多仪器上海有限责任公司）；旋转蒸发仪（RE-52AAA型，上海伊利仪器制造有限公司）；万能高速粉碎机（DFY-800C型，温岭市林大机器有限公司）；电热鼓风恒温干燥箱（型号：DHG-9075A，上海齐欣科学仪器有限公司）；离心机（低速离心机，常州国华电器有限公司）。

1.2 试验方法endprint

1.2.1 小黑药总黄酮的提取。小黑药全株干粉用75%乙醇回流提取4次，每次提取时间为3 h，将回流提取液在旋转蒸发仪中减压浓缩，用石油醚萃取浓缩液3次除去大量的叶绿素、蜡等物质。下层进一步浓缩制样，用硅胶层析柱分离，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脱除尽叶绿素，然后用75%乙醇洗脱黄酮，用减压浓缩回收乙醇。浓缩液加入1%碱式醋酸铅，使黄酮类物质沉淀，用离心机分离沉淀，沉淀用无水乙醇分散后用10%硫酸调pH值为1～2，温热分解，抽滤得到清液，清液用饱和碳酸钠溶液调pH值为6～7，再减压浓缩后用聚酰胺柱层析法进行分离，先用蒸馏水洗脱，再用无水乙醇洗脱，将无水乙醇洗脱物旋干后用无水乙醇溶解离心清液即为小黑药待测总黄酮溶液。

1.2.2 最大波长的确定。于10 mL容量瓶中加入质量浓度为0.336 0 mg/mL芦丁标准溶液2.00 mL、5%亚硝酸钠0.6 mL、无水乙醇3.0 mL，摇匀后放置6 min，然后加入10%硝酸铝溶液0.6 mL，摇匀后放置6 min，再加入8.6%氢氧化钠3.0 mL，并用50%乙醇定溶至刻度。在400.00～600.00 nm的范围扫描，最大吸收处为508 nm。

1.2.3 标准曲线的建立。在10 mL容量瓶中，分别加入0.336 0 mg/mL芦丁标准溶液（质量浓度）0、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10 mL，按1.2.2方法显色，在508.00 nm处测定吸光度，得标准曲线回归方程如下：

y=0.008 2x+0.002 7，R2=0.999 4

1.2.4 小黑药待测总黄酮含量的测定。小黑药待测总黄酮溶液1.00 mL置10 mL容量瓶中用无水乙醇定容至刻度，在10 mL容量瓶中加入稀释后的总黄酮溶液0.30 mL，按1.2.2方法显色，并测定508 nm吸光度，由标准曲线回归方程得出样液总黄酮含量相当于芦丁的含量为28.386 1 mg/mL。考虑到试验与芦丁的对比，把待测总黄酮溶液稀释到浓度0.336 0 mg/mL得总黄酮测试液。

1.2.5 回收率试验。于10 mL容量瓶中加入小黑药待测总黄酮溶液0.25 mL、0.336 0 mg/mL芦丁溶液2.00 mL；于10 mL容量瓶中加入小黑药待测总黄酮溶液0.25mL；取0.336 0 mg/mL芦丁对照品溶液2.00 mL。3个处理均按1.2.2方法显色，并在508 nm处测定吸光度，分别由回归方程计算得黄酮含量为A、B、C。计算得到总黄酮回收率为96.24%。公式如下：

回收率（%）=■×100

1.2.6 小黑药全株总黄酮含量的测定。准确称取小黑药全株干粉2.000 9 g，用75%乙醇提取4次，每次提取时间为3 h，将回流提取液在旋转蒸发仪中浓缩后制样，用硅胶层析柱分离，先用石油醚∶乙酸乙酯=6∶4（v/v）洗脱除去叶绿素，然后用75%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩制样，再过聚酰胺柱，先用蒸馏水洗脱，再用无水乙醇洗脱，乙醇洗脱液减压除去溶剂，用无水乙醇定容于25 mL容量瓶中，从中取0.30 mL溶液于10 mL容量瓶中，按1.2.2方法显色，在508 nm处测吸光度，由标准曲线回归方程计算总黄酮。

1.2.7 过氧化值的测定。按照GB/T5009.37中方法配制铁标准储备溶液和使用溶液等，然后用分光光度计按标准中的方法检测绘制标准曲线。油样过氧化值检测按照GB/T5009.37中比色法检测。回归方程如下：

y=0.027 3x-0.011 3，R2=0.999 0

1.2.8 光照诱导氧化法。分别取3支50 mL比色管，加入50.000 0 g猪油。第一管加入0.010 0 g小黑药总黄酮，第二管加入0.010 0 g二丁基羟基甲苯（BHT），第三管作为空白对照。放入光化学反应仪，于室温条件下用100 W紫外灯照射，每隔30 min分别取样0.500 0 g于10 mL容量瓶中，按GB/T5009.37中比色法检测，每组平行做3次。

1.2.9 烘箱诱导氧化法。分别取3支50 mL比色管，加入50.000 0 g猪油。第一管中加入0.010 0 g小黑药总黄酮，第二管加入0.010 0 g二丁基羟基甲苯（BHT），第三管作为空白对照。将上述3支比色管置于60 ℃恒温箱内，每48 h分别取样0.500 0 g于10 mL容量瓶，按GB/T5009.37中比色法检测，每组平行做3次。

1.2.10 评价方法。按文献[2，6]中相对防效值和Pb值的计算方法做适当修改，按下列公式计算POV抑制率（%），POV抑制率越大说明抗氧化效果越好。POV抑制率下降越小说明抗氧化持续时间能力就越大。

抑制率（POV）（%）=■×100

1.2.11 还原能力的测定。分别取总黄酮测试液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，于25 mL的比色管中，并补充水至0.50 mL（即得质量浓度为67.20、134.40、201.60、268.80、336.00 μg/mL总黄酮溶液），采用不加铁氰化钾的为对应空白样（共6份）。分别加入0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH=6.6）2.50 mL和1%铁氰化钾2.50 mL混合均匀，于50 ℃水浴中反应20 min后快速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，混合均匀（澄清无需离心）。取清液2.50 mL于试管中，加入蒸馏水2.50 mL，再加入0.1%三氯化铁溶液0.50 mL，混合均匀，于室温下静置反应10 min，1 cm石英比色皿在700 nm处测定吸光度值。质量浓度为0.336 0 mg/mL的对照样芦丁其还原能力测定方法同上。

1.2.12 抑制O2-·试验。分别取总黄酮测试液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，于25 mL比色管中，补充水至5 mL。各加入pH=8.2的Tris-HCl缓冲溶液4.70 mL、3 mmol/L邻苯三酚溶液0.30 mL（试验样液测试时浓度分别为3.36、6.72、10.08、13.44、16.80、20.16 μg/mL），用纯水作空白，测试温度13 ℃（测试液体温度），用1 cm石英比色皿在320.00 nm波长下测试，吸光值为Ax，以10 mmol/L盐酸缓冲溶液0.30 mL代替邻苯三酚溶液测定的吸光值为Axo。用纯水代替试验样液（加水5 mL）测得的吸光值为Ao，用纯水代替试验样液和邻苯三酚（加水5.3 mL）测得的吸光值为Aox。质量浓度为0.336 0 mg/mL的对照样芦丁，试验方法同上。试样对超氧阴离子自由基的抑制率为：endprint

抑制率（%）=（1-■）×100

1.2.13 清除DPPH试验。于250 mL容量瓶中，加入称取的DPPH 20 mg，并用无水乙醇溶解定容，配制成质量浓度2×10-4 mol/L的DPPH溶液，于0～4 ℃下避光保存。分别取总黄酮测试液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于25 mL比色管中，补充乙醇至2.00 mL，然后加入配制好的DPPH溶液2.00 mL混匀（试验样液质量浓度为8.40、16.80、25.20、33.60、42.00、50.40 μg/mL），于室温暗处放置反应30 min，在517 nm下测得的吸光值为A1，以2.00 mL乙醇代替样液所测得的吸光值为A2，以2.00 mL乙醇代替DPPH溶液测得的吸光值为A3（空白）；质量浓度为0.336 0 mg/mL的对照样芦丁，试验方法同上。试样对DPPH的清除率为：

清除率（%）=（1-■）×100

1.2.14 清除·OH试验。分别取总黄酮测试液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，于25 mL的容量瓶中，各加入6 mmol/L硫酸亚铁2.00 mL、6 mmol/L过氧化氢2.00 mL，放置25 min后，用6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液定容至25 mL（即样液测试质量浓度为1.34、2.69、4.03、5.38、6.72、8.06 μg/mL）。在36～37 ℃恒温水浴中反应15 min，1 cm石英比色皿于510 nm处测定吸光度值Ax，以乙醇代替试验样液测得吸光度值为Ao（空白管乙醇），以乙醇代替水杨酸-乙醇组测得吸光度值Axo（空白管），以乙醇代替试验样液、水杨酸-乙醇的为空白管。质量浓度为0.336 0 mg/mL的对照样芦丁，方法同上。试样对羟基自由基的清除率为：

清除率（%）=（1-■）×100

2 结果与分析

小黑药全株总黄酮含量见表1。表2、表3说明小黑药总黄酮对油脂的光诱导氧化和自动氧化都有抗氧化的效果。光诱导氧化、烘箱法诱导氧化的POV抑制率平均值分别为24.56、8.72%，说明总黄酮对抗光引发油脂的抗氧化效果高于自动氧化的效果。POV抑制率下降的趋势说明总黄酮抗油脂自动氧化的持续能力优于光引发氧化的能力。与抗氧化剂BHT的POV抑制率对比表明在同样使用量的情况下总黄酮的效果不如BHT。但从食用安全性角度考虑总黄酮具有较大的优势，如果增加总黄酮的量也会有较好的抗油脂氧化的效果。

抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基，还原能力越强，抗氧化性越强[7]。通过测定还原能力可说明抗氧化性的大小[8]。表4说明小黑药总黄酮表现出较好的还原能力，随着试样质量浓度的增加，还原能力逐渐增强，但效果略低于芦丁。

超氧阴离子自由基的形成最早，是氧进行单电子的还原反应首先生成的产物。由它可生成羟自由基（·OH）、过氧化氢、脂质过氧化物（ROOH）及单线态氧等其他活性氧，引发人体许多疾病的生理变化[9]。表5数据说明随总黄酮和芦丁质量浓度增大抑制效果提高，在低浓度时总黄酮的效果略高于芦丁，高浓度时略低于芦丁，对O2-·抑制效果随时间的延长逐渐下降，且趋势基本一致。

N，N-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）是一种很稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm 波长处有强吸收（深紫色）。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子数配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子成定量关系，所以可以较迅速地评价物质的抗氧化能力[4]。由表6可知，小黑药总黄酮和芦丁对DPPH自由基的清除能力很强，总黄酮对DPPH自由基的清除能力随质量浓度的增大逐渐提高，质量浓度大于33.60 μg/mL后清除能力趋于稳定，虽然芦丁对DPPH自由基的清除能力略优于总黄酮，但总黄酮对DPPH自由基的清除能力随质量浓度的增大，其清除率增加值优于芦丁。

羟自由基是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、

蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。由表7可知，总黄酮对羟基自由基的清除能力在试验质量浓度范围内优于芦丁，且清除率随质量浓度的提高清除能力趋势与芦丁基本一致。

3 结论

研究结果表明，小黑药全株总黄酮含量为2.52%，抗猪油光氧化的效果高于自动氧化的效果，对于油脂产品在货架期的保质是有利的。表现出较好的还原能力、抑制率超氧阴离子自由基能力、清除DPPH自由基和羟基自由基的能力，在食用和保健方面都有较好的开发利用价值。

4 参考文献

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