小黑麦花粉干燥法超低温保存技术研究

2015-11-26徐翠莲王瑞清张俐敏田依轩胡文明

湖北农业科学 2015年21期

徐翠莲王瑞清张俐敏田依轩胡文明

摘要：为了满足种质资源保存、交换及杂交育种工作的需求，对小黑麦花粉活力及影响小黑麦花粉超低温保存效果的因素进行了研究。结果表明，采用TTC染色法测定小黑麦花粉的活力，结果相对准确，且其适合的浓度为0.1%；采用硅胶干燥处理3 h后，小黑麦花药相对含水量为34.5%，比较适合超低温保存，且保存前后花粉活力保持稳定，其活力相对保持率为92.3%；超低温冷冻保存5 d后，采用不同的化冻方式进行化冻，结果发现自来水冲洗化冻后小黑麦花粉活力相对较高，说明自来水冲洗化冻是简便适合的化冻方式。

关键词：小黑麦；花粉活力；花粉相对含水量；超低温保存；化冻方式

中图分类号：S512.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5223-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.006

Studies on Cryopreservation of Triticale Pollen after Drying Treatment

XU Cui-lian， WANG Rui-qing， ZHANG Li-min， TIAN Yi-xuan. HU Wen-ming

（College of Plant Science， Tarim University， Alar 843300， Xinjiang， China）

Abstract： In order to meet the demands of germplasm resources preservation， exchange and cross breeding， triticale pollen vitality and the cryopreservation-influencing factors were studied in this research. The results showed that， TTC staining method was relatively accurate for determining the triticale pollen vitality， and the suitable concentration was 0.1%； moreover， it was more suitable for cryopreservation when relative water content of anther reached to 34.5% after dried three hours by silica gel， which made pollen vitality stable and its vitality relative retention rate was 92.3%.In addition， different ways of defrosting were studied after five days of cryopreservation， and the results showed that the pollen vitality was relatively high when adopting method of tap water washing， indicating that tap water defrosting was more simple and applicable.

Key words： triticale； pollen vitality； relative water content of triticale anther； cryopreservation； ways of defrosting

花粉是种子植物特有的生殖器官的一部分。花粉活力指成熟的花粉在离体条件下存活且一段时间内授粉具备结实能力。然而不同植物花粉活力持续的时间长短不同，即寿命不同。因此，充分了解植物花粉的生活力特性在植物种质资源保存等研究中具有重要的意义。

花粉寿命的长短，除受到遗传因素决定外，还受环境的影响[1，2]。其中对花粉活力影响较大的环境因素是贮藏温度和花粉本身的含水量。花粉贮藏常见的方法有低温干燥法、真空贮藏法、冻干贮藏法、超低温贮藏法、有机溶剂保存法等。其中超低温贮藏法利用液态氮将花粉贮藏在-196 ℃条件下，被认为是目前实现花粉种质“永久”的最理想的方法之一。花粉的超低温保存能解决诸如制种中花时花期不遇的问题，能使不同时间开花、花期不一致的植物正常授粉结实，也能使不同地点开花的植物实现正常的授粉结实。花粉的超低温保存技术在果树、林木[3，4]和花卉[5-8]中研究或应用较多，但在作物中研究的较少[9-11]。

禾本科植物花粉寿命很短，一般在开花散粉后几个小时内花粉活力降低很快，不利于花粉活力研究和育种工作的开展。因此，采用超低温冷冻技术延长花粉寿命为麦类远缘杂交育种和种质资源的保存、交流提供便捷的途径，有一定的应用价值。鉴于目前超低温保存技术在保存植物花粉中的应用可以发现，花粉材料的种间特异性很强，不同种植物的花粉超低温保存可能需要不同的技术方案，还没有找到一种可以适用于所有花粉超低温保存的技术方案。本研究拟对不同小黑麦品种的花粉进行超低温保存研究，旨在确立小黑麦花粉超低温冷冻保存的技术，为小黑麦育种，尤其是跨时间、跨地区的杂交育种提供方便，同时为禾本科花粉的长期冷冻保存提供理路依据和技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验条件

供试材料为新小黑麦1号、新小黑麦3号、新小黑麦4号和新小黑麦5号，由石河子大学麦类作物研究所提供。试验于2012—2013年在塔里木大学园艺试验站和园艺实验室进行。采用随机区组试验设计，重复2次，每小区种植10行，行长3 m，行距15 cm，四周设保护行。试验地肥力中等，试验田基施220 kg/hm2尿素、150 kg/hm2磷酸二铵，拔节期随水施80 kg/hm2尿素、60 kg/hm2 KH2PO4，扬花灌浆期施70 kg/hm2尿素、60 kg/hm2 KH2PO4。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉活力及花药相对含水量测定于小黑麦扬花期的晴天上午10：00左右，选取长势一致、当日待开花散粉的麦穗20个，减去1/3颖壳，用镊子拨出花药，备用。将花药装入1.5 mL离心管，采用室温自然干燥（A）和干燥皿内硅胶干燥（B）2种方法进行干燥，每隔1 h分别取少许花粉进行花粉活力及含水量测定，其余的用于超低温保存，以未经干燥处理的花粉及花粉直接投入液氮进行超低温保存为对照。

花粉活力测定：取少许花粉于载玻片上，分别采用碘-碘化钾（I2-KI）溶液、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，以75%乙醇处理的花粉为对照。每个处理制作2～3个制片，于30 ℃恒温箱中放置20～30 min后镜检。每个制片随机选取5个视野，记录花粉总数和有活力花粉的数目，取其平均值，计算花粉活力。

花药相对含水量测定：采用烘干法。将离心管在120 ℃的烘箱中烘至恒重w1，然后放入适量（0.1～0.2 g）花粉，称重得数据w2，每隔1 h分别取样放入120 ℃烘箱中烘至恒重，取出放入干燥皿内冷却后称重，记下读数w3。花药相对含水量y=（w2-w3）/（w2-w1）×100%，2次重复。

1.2.2 花粉的超低温保存及化冻处理将新鲜花粉或经干燥处理的花粉装入冻存管，投入液氮（-196 ℃）进行贮藏，24 h后取出花粉，分别采用自来水冲洗化冻、室温化冻、37 ℃水浴化冻，待恢复至室温后进行测定，记录保存前后花粉的活力，计算花粉活力相对保持率。花粉活力相对保持率=保存后花粉活力/保存前花粉活力×100%。

1.3 试验数据的处理与分析

采用SPSS 19.0统计分析软件对数据进行差异显著性检验，用Microsoft Excel 2003软件作图。

2 结果与分析

2.1 花粉活力测定方法的筛选与确定

花粉活力代表了花粉的生活能力，有活力的花粉可以用于杂交授粉，完成植物受精过程。新鲜的花粉粒是最富有生命力的，但在杂交育种实践中，由于各种植物花粉的寿命长短不同和花期不一致，需要把花粉保存一段时间再用，或因需要从其他地方运来花粉。因此，授粉前快速测定花粉活力显得十分有必要。

取新小黑麦3号的新鲜花粉，分别采用I2-KI、TTC染色法测定其花粉活力，染色结果（图1）表明，利用I2-KI对小黑麦花粉进行染色，花粉呈现蓝色和褐色2种颜色，且染色效果不随时间的延长而发生变化。成熟的花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I2-KI溶液可将其染成蓝色，而发育不良的花粉呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉较少，I2-KI溶液染色呈黄褐色，失活的花粉以及经过乙醇处理的花粉（对照）遇碘同样呈蓝色反应。因而I2-KI溶液染色法不能很好地区分有活力的花粉和已丧失活力的花粉。利用TTC染色，花粉细胞出现红色、淡红色和无色3种颜色反应，且随时间的延长细胞的染色率逐渐下降。花粉经乙醇处理后（对照）失活，用TTC染色，不能着色。说明TTC染色法测定小黑麦花粉活力相对准确。本研究用1%TTC进行染色，结果发现新小黑麦3号的新鲜花粉染色率相对较低，为50%左右，分析认为是高浓度的TTC对花粉细胞有毒害作用。而用0.1%TTC和0.5%TTC染色后花粉着色率相对较高，分别为92.3%和79.1%。方差分析表明，不同浓度TTC染色液染色结果间存在极显著（P<0.01）差异。因此，TTC溶液浓度为0.1%时较适合用来测定小黑麦花粉的活力。

2.2 花药相对含水量的测定结果

由图2可知，随着干燥时间的延长，新小黑麦1号的花药相对含水量逐渐降低，与室温自然干燥相比，采用硅胶干燥法水分散失较快，干燥效果相对较好。正在散粉的小黑麦花药的初始相对含水量平均为71.65%，干燥处理1～3 h内水分散失较快，3 h后室温干燥花药含水量达到45.8%，硅胶干燥花药含水量达到34.5%，7 h后花药相对含水量分别为18.5%、10.0%。对花药相对含水量（y）和干燥时间（x）进行拟合，结果发现自然干燥和硅胶干燥的花药相对含水量与干燥时间均呈极显著（P<0.01）负指数关系，拟合方程分别为：y=91.71×EXP（-0.182x），r2=0.967 9；y=102.47×EXP（-0.293x），r2=0.992 9。

2.3 花药相对含水量对小黑麦花粉超低温保存效果的影响

分别将新小黑麦1号的新鲜花粉（P1）、硅胶干燥处理3 h（P2）和6 h（P3）的花粉投入液氮保存5、10 d后，取出在自来水下快速化冻测定其花粉活力，结果如表1所示。由表1可知，在超低温保存下，随着时间延长不同处理的花粉活力变化趋势明显不同。经过硅胶干燥处理3 h的花粉放入液氮经超低温冷冻保存后，其活力基本呈现稳定趋势，最终活力稳定在78.0%，保存前后花粉活力相对保持率为92.3%。这是由于干燥处理后的花粉相对含水量低，在超低温保存及化冻过程中不易产生冰晶，花粉活力基本保持不变。新鲜花粉在超低温保存前后的活力变化很大，保存5 d和10 d后花粉活力分别由99.8%降低至44.5%和28.6%，这是由于新鲜花粉含水量高，在结冻与化冻的过程中容易产生冰晶使细胞膜受损。经硅胶干燥处理6 h的花粉在投入液氮前活力已经很低，不适合保存，这是由于小黑麦的花粉是三核型花粉，不耐干燥，延长干燥时间会导致小黑麦花粉活力降低，经过超低温保存后活力很低，最终花粉活力保持率为36.1%。显著性检验结果（表1）表明，经硅胶干燥处理3 h的花粉在超低温保存前后，其花粉活力差异不显著（P>0.05）。因此，硅胶干燥3 h的花粉比较适合小黑麦花粉的超低温保存。液氮超低温冷冻保存是相对较为理想的保存方式，相对干燥的小黑麦花粉的活力随着时间的延长不会出现明显的下降趋势，理论上可以长时间保存。

2.4 化冻方法对小黑麦花粉超低温保存效果的影响

分别取新小黑麦1号、新小黑麦3号、新小黑麦4号和新小黑麦5号的花粉在硅胶中干燥处理3 h后进行超低温冷冻保存，保存5 d后取出，分别采用室温（23 ℃）、37 ℃水浴和自来水冲洗化冻3种方法进行化冻处理，30 min后测定其花粉活力，结果如图3所示。由图3可知，新小黑麦1号、新小黑麦3号、新小黑麦4号和新小黑麦5号的花粉在液氮保存5 d后，采用自来水冲洗化冻，其最终的花粉活力最高，37 ℃水浴化冻的活力次之，室温下自然化冻的花粉活力最低。显著性检验表明，新小黑麦1号和新小黑麦3号在37 ℃水浴化冻和自来水冲洗化冻下花粉活力差异不显著（P>0.05），但二者显著（P<0.05）高于室温化冻时的活力；而新小黑麦4号和新小黑麦5号在不同化冻方式下均存在显著差异（P<0.05），以自来水冲洗化冻方式花粉活力最高。因此，用自来水冲洗化冻是简便适合的化冻方式。

3 结论与讨论

3.1 花粉活力测定方法的筛选与确定

多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I2-KI溶液可将其染成蓝色；而发育不良的花粉往往不含淀粉或积累淀粉较少，染色呈黄褐色，而已丧失活力的花粉和经过乙醇处理的花粉（对照）因为细胞内存在有淀粉，遇碘同样呈蓝色反应。因而I2-KI溶液染色不能很好地区分有活力的花粉和无活力的花粉，不适用于对小黑麦花粉活力的测定。

TTC是呼吸链系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，凡被染为红色的花粉活力强，淡红色次之，无色的为没有活力或不育花粉，因此花粉细胞出现红色、淡红色和无色3种颜色反应。对照花粉经乙醇处理后失活，用TTC染色不能着色，说明TTC染色结果能很好地区分有活力的花粉和无活力的花粉，适合小黑麦花粉活力的测定。另外，高浓度的TTC对花粉细胞的毒性作用会导致某些有活力的花粉随着时间的延长逐渐褪色，使试验结果偏低。本研究将TTC溶液浓度降低到0.1%，染色效果较好。

3.2 花药相对含水量和贮藏温度对花粉活力的影响

新鲜花药的含水量较高，其活力和萌发力较高。花药含水量越高，进行低温贮藏时越容易形成冰晶，使细胞膜受损，花粉死亡率就越高，达不到贮藏的目的。所以为了避免冷冻时细胞内结冰，提高花粉存活率，在冷冻保存之前必须对花粉进行干燥脱水处理。进行花粉干燥既要把含水量降低，控制在一定范围之内，又要保证花粉保持较高活力和萌发力。本试验结果表明，小黑麦的花药相对含水量在30%左右时是放入液氮内保存的最佳时期。

本研究结果认为，超低温和干燥处理是花粉活力得以延长的必要条件，这与前人的结果一致[12-14]。超低温降低了花粉内部呼吸强度，而花粉保存前的干燥处理抑制了花粉代谢，降低了酶的活力，避免了花粉冷冻和化冻过程中的伤害，从而使花粉寿命得以延长。

3.3 化冻方法对小黑麦花粉活力的影响

花粉的化冻方式一般有自然化冻、室温化冻、自来水冲洗化冻等几种方式。许多研究认为，液氮保存对植物的伤害是在冰冻和化冻两个过程中发生的，因此要使植物花粉的超低温保存获得成功，选择合适的化冻方法是最重要的。较好的化冻方式既能避免在化冻过程中产生花粉细胞内的再次结冰，又能防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。研究结果表明，超低温保存材料在化冻时再次结冰的危险温度区大约是-5～10 ℃[14]，所以化冻一般在35～40 ℃温水中进行，借助迅速的化冻速度通过此温度区，避免细胞内次生结冰对细胞的致死性破坏。王彩红等[15]采用0、16、37 ℃ 3种温度进行化冻，研究显示含水量为7.3%的材料采用任何一种化冻温度都获得良好效果，花粉含水量较高时采用37 ℃温水化冻较好。本试验采用37 ℃水浴、自来水冲洗、自然化冻3种方法，试验结果表明，自来水冲洗是简便易行且较适合的化冻方式。

干燥法超低温保存是贮藏小黑麦花粉的相对较为理想的保存方式，然而关于超低温保存前后花粉生理生化变化和遗传性状稳定性等机理仍有待于进一步研究。

参考文献

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