香蕉假茎中产碱性果胶酶细菌的筛选发酵优化与酶学性质

刘长高，何忠平，张玉苍，席小勇



香蕉假茎中产碱性果胶酶细菌的筛选发酵优化与酶学性质

刘长高，何忠平，张玉苍，席小勇

（海南大学材料与化工学院，海南海口 570228）

利用果胶酶处理天然纤维对环境污染小，然而筛选高产量的菌株仍是降低成本获得果胶酶的关键。本文利用以果胶为唯一碳源的培养基，从香蕉假茎中分离筛选出了一株具有较高果胶酶活性的菌株。经16S rDNA序列分析表明，该菌株与枯草芽孢杆菌（）具有99%的相似性，将该菌株命名为sp. ZLXH-5。该菌株最佳发酵时间为2天，最佳发酵温度是37℃，最佳初始pH值是5，最佳转速是180r/min，最佳葡萄糖浓度为15g/L。通过发酵条件优化，果胶酶产量提高了56.6%。对粗酶液的性质进行分析，其在55℃下达到最佳反应速率，最适催化pH值是8.5，不同的离子对于果胶酶的活性起到不同的效果。由于该菌株具有较高的果胶酶活性，可以利用该菌株对香蕉假茎进行生物脱胶。

果胶酶；发酵优化；生物脱胶；香蕉假茎

海南岛是我国香蕉主产区之一，每年有大量的香蕉假茎遭到废弃，造成资源的极大浪费，同时对当地的环境产生一定的破坏。香蕉假茎作为生物质废弃物，可以从中提取出香蕉纤维。香蕉纤维可以用于纺织和造纸，具有优异的性能，如密度低、柔韧性和力学性能良好。此外，香蕉纤维具有可再生性，成本低廉等特点[1-2]。印度、日本已有利用香蕉纤维作为纺织原料的报道，国内对于香蕉纤维的研究起步较晚。提取香蕉纤维的方法主要包括机械法，化学法和生物法。机械法效率较低，而化学法造成的污染大，同时可能对纤维造成损伤，对比而言，生物法不存在上述缺点，因此越来越受到人们的重视[3-5]。果胶是一种植物多糖，是胞间层和初生细胞壁的组成成分，其主链由D-半乳糖醛酸残基组成，主链上也包含鼠李糖残基[6]。生物法主要是利用产碱性果胶酶细菌或者直接用碱性果胶酶处理香蕉假茎，从而得到香蕉纤维。

果胶酶是一类水解酶的总称，用于造纸原浆处理、纺织行业、医药行业、食品加工、环境保护、饲料生产等，在工业上用途非常广泛。用于纺织和造纸的果胶酶多为碱性果胶酶，其最主要的一种是聚半乳糖醛酸裂解酶（polygalacturonate lyase，PGL），该酶作用于多聚半乳糖醛酸上的糖苷链，通过反式消除催化果胶反应，生成不饱和的产物。PGL必须在有Ca2+的存在才具有催化活性，在EDTA存在的情况下，其活性消失[7-9]。主要的产生菌包括：芽孢杆菌、欧文氏菌、假单胞菌、链霉菌和一些腐生菌[10]。使用碱性果胶酶处理香蕉纤维可以大大减少化学试剂的使用，减少污染、降低能耗、减少工业用水，此外纤维柔软度和强度也能够得到提高，因此果胶酶的应用将会是纺织工业未来的发展方向。目前工业上使用的碱性果胶酶主要来源于枯草芽孢杆菌。现在尚未检索到高效脱胶方法的报道，因此，通过筛选得到高产量的菌株仍是降低生产成本获得果胶酶的关键[8，11]。本研究从香蕉假茎中筛选出了一株具有较高果胶酶活性的芽孢杆菌属菌株，对其产酶条件进行初步优化，并对其酶学性质进行了研究，为该菌株在香蕉纤维生物脱胶方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香蕉假茎，取自海南省琼海市潭门镇。

1.2 试剂

果胶购自Sigma公司；D-半乳糖醛酸来自Fluka；其他试剂均为国产试剂，分析纯。

1.3 各培养基配方

初筛和复筛培养基[12]：果胶5g，NH4NO33g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.2g，NaCl 0.5g，FeSO40.01g，吐温2g，琼脂15g，加入去离子水至体积为1L，pH值自然。

产酶培养基[12]：果胶5g，NH4NO33g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.2g，NaCl 0.5g，FeSO40.01g，吐温2g，加入去离子水至体积为1L，pH值自然。

细菌保存培养基[13]：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，加入去离子水至体积为1L，pH自然。

种子培养基[13]：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加入去离子水至体积为1L，pH值自然。

1.4 DNS试剂的配制

称取3,5-二硝基水杨酸 6.3g，加入2mol/L的NaOH溶液262mL，加入185g酒石酸钾钠，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，加蒸馏水定容至1000mL。贮于棕色试剂瓶中，放置1周后 备用[14]。

1.5 筛选方法

1.5.1 细菌的初步筛选

将取得的香蕉假茎切成1cm×1cm的正方形，接种于初筛培养基，在培养箱中37℃培养，待香蕉假茎周围长出菌落，选取相应的细菌于平板（保存培养基）划线，培养箱中37℃培养1天，挑选单菌落，接种于细菌保存培养基中，培养1天。将培养皿密封，置于4℃冰箱保存。

1.5.2 细菌复筛

将初步筛选得到的细菌接种于复筛培养基中，以点种的方式接种，每个培养皿点种3次。接种后，将其置于培养箱中37℃培养2天，然后利用碘液进行染色，测定菌落的大小以及水解圈的大小[15]，选取水解圈较大的菌株接种于发酵培养基，37℃培养2天，进行果胶酶活性测定，选取果胶酶活性较高的菌株作为目标菌株。

1.6 果胶酶活性的测定

采用DNS法测定果胶酶活性[16]，底物pH值调节至9。酶活力单位的定义：在50℃下，每分钟催化得到1μg还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。

发酵优化过程中粗酶液的制备：接一环菌种于种子培养基中，37℃培养1天，再取100μL菌液接种于100mL的产酶培养基，在摇床上37℃，培养2天。4℃下5000r/min离心10min，取上清液，得到粗酶液，置于冰箱中4℃保存。

1.7 产果胶酶细菌的16S rDNA测序及系统发育树构建

产果胶酶细菌的测序委托深圳华大基因科技有限公司完成，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，上游引物F27，序列为5'- d(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)-3'，下游引物R1492，序列为 5'-d(GGTTACCTTGTTACGACTT)- 3'。然后进行16S rDNA测序，将测序获得的16S rDNA序列提交到GenBank并获得收录号，与美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）数据库收录的细菌16S rDNAs进行BLAST比对，选择与spZLXH-5同源性较高的代表菌株，利用MEGA 5.0软件构建进化树。

1.8 产酶条件优化及数据分析

对影响菌种产酶条件的发酵时间、发酵温度、初始pH值、转速和葡萄糖浓度进行了优化，分别选取发酵时间梯度：1天、2天、3天、4天、5天；发酵温度梯度：28℃、31℃、34℃、37℃、40℃；初始pH值梯度：3、4、5、6、7。转速梯度：90r/min、120r/min、150r/min、180r/min、210r/min。葡萄糖浓度：0、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L。每一个因素的同一个水平做3个重复。

1.9 数据分析

利用Excel 2013和SPSS 19.0对数据结果进行处理和分析，显著性水平为0.05，所有数据在分析之前进行方差齐性检验。对各因素中的水平进行单因素方差分析，采用最小显著差数法（LSD）进行两两对比，利用Origin 9.0作图。

1.10 果胶酶的性质

确定了菌株产果胶酶的最佳发酵时间、温度、pH值和转速后，利用上述最佳条件发酵获取粗酶液，测定粗酶液的最佳催化温度，最佳催化pH值，测定果胶酶随时间变化的曲线。通过加入不同种类的盐如KCl、MnCl2、CuCl2、FeCl2、CaCl2、ZnCl2、MgCl2，检测离子对果胶酶的促进或抑制作用。

2 结果与讨论

2.1 菌种Bacillus sp. ZLXH-5水解圈

图1为菌株spZLXH-5形成的水解圈照片。该菌株菌落呈白色，菌落较大，周围有较大的水解圈出现。经革兰氏染色后，菌株呈紫色，因此为革兰氏阳性细菌。

2.2 16S rDNA序列测定及系统发育树分析

通过测序，得到该菌株的16S rDNA序列，该序列在GenBank的序列登录号为KM823927。用MEGA 5.0软件的邻位相连法（Neighbor-Joining）将该菌株的16S rDNA序列和从GenBank选择的与其同源性较高的菌株一起来构建系统发育树，进行1000次Bootstrap自举法检验，其结果如图2所示。根据系统发育树，spZLXH-5与芽胞杆菌属（）处于同一分支，支持度高达99%。综合革兰氏染色结果以及16S rDNA序列的相似性，鉴定该菌株为芽胞杆菌属（）。

2.3 发酵条件优化

2.3.1 最佳发酵时间的确定

如图3所示，菌种在发酵开始后产酶量迅速增长，2天后趋于最高值，2天和3天产量没有显著差异，因此本研究选择2天为最佳发酵时间。芽胞杆菌属细菌产酶的最佳时间多为1天[17]，本文选择的发酵时间较长，可能原因是发酵培养基中碳源含量较低，仅为0.5%，微生物生长受到抑制，导致发酵时间延长。

2.3.2 最佳发酵温度的确定

如图4所示，该菌种在31～37℃内能够稳定产酶，在温度低于31℃或是高于37℃时，果胶酶产量降低，最佳发酵温度选择为37℃。该菌株在较大的温度范围内能够稳定产酶，31～37℃果胶酶产量差异较小。

2.3.3 最佳初始pH值的确定

初始pH值对于菌种产果胶酶有很大的影响，pH值能够改变底物的带电性，也可以使细菌原生质体膜的电荷发生改变，从而影响细菌对营养物质的吸收。从图5可以看出，初始pH值低于5或是高于6时，果胶酶产量急剧降低，因此，该果胶酶初始pH值范围限定在5～6之间，本研究选择最佳初始pH值为5。

2.3.4 最佳转速的确定

转速对于摇瓶中的溶氧量有影响，转速越快，培养基中溶解的氧越多，如图6所示，菌种在180～210r/min内果胶酶产量达到最大，从能耗和酶产量两个因素综合考虑，选择180r/min作为最佳转速。

2.3.5 葡萄糖浓度对果胶酶产量的影响

从图7可以看出，加入葡萄糖能够提高果胶酶的产量。可能的原因是在没有加入葡萄糖时，培养液中单糖含量较低，不利于菌体的生长，加入适量葡萄糖后，促进了菌体生长，从而使果胶酶产量提高。但是，从图7中的结果可以看出，当葡萄糖浓度超过15g/L后，果胶酶的产量随着葡萄糖浓度的增加不再增长，而pH值减小，很有可能是当葡萄糖浓度进一步增加时，细菌开始产酸，造成pH值下降，果胶酶产量不再增长。通过发酵条件优化，果胶酶产量提高了56.6%，达到了3401.8U/mL（优化之前，果胶酶的产量为2172.6U/mL）。一般认为野生菌经过发酵优化后产碱性果胶酶的水平为2.12～2121U/mL[11]，本研究的果胶酶产量明显高于该范围，因此具有可开发的前景。

2.4 果胶酶的活性

2.4.1 温度对于果胶酶活性的影响

温度对于果胶酶活性具有较大的影响，温度过高容易使酶变性，温度过低，酶促反应速率较低。从图8可以看出，果胶酶的活性在55℃时达到最大，在50～60℃时，果胶酶的活性比较稳定。

2.4.2 pH值对于果胶酶活性的影响

pH值对于果胶酶活性影响较大，pH值过大或是过小都会引起酶失活。如图9，在pH值为8.5时果胶酶活性达到最大，当低于8.5或者高于10时，果胶酶活性急剧下降。

2.4.3 果胶酶活力随时间的变化

如图10所示，在5～40min内，果胶酶的活力急剧降低，40min后，果胶酶活力降低速度减小。这是由于在反应初期，底物浓度极高，正向的催化反应速率较高，随着反应的进行，产物的浓度增加，从而加速了逆反应的进行，导致酶促反应速率减小。

2.4.4 不同金属离子对果胶酶活性的影响

从表1可以看出，各种离子对果胶酶活性的影响不相同。K+对果胶酶活性起到轻微的抑制作用，Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+对酶的抑制作用非常明显，Ca2+能够明显地促进果胶酶的活性，其原理是Ca2+与碱性果胶酶的活性中心结合，具体与Ca2+结合的是催化中心的赖氨酸残基，从而提高了果胶酶的催化活性。此外，Ca2+能够在聚半乳糖醛酸之间形成盐桥[19-20]，而Mg2+对果胶酶活性的影响不明显。

表1 金属离子对果胶酶稳定性的影响

3 结 论

通过利用以果胶为唯一碳源的培养基，从香蕉假茎中分离筛选出了一株具有较高果胶酶活性的菌株，该菌株属于芽胞杆菌属。经过发酵条件优化，得到该菌株的最佳发酵时间是2天，最佳发酵温度是37℃，最佳初始pH值是5，最佳转速是180r/min，最佳葡萄糖浓度为15g/L。通过对酶学性质进行分析，得到粗酶液的最佳催化温度是55℃，最佳催化pH值是8.5，Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+抑制果胶酶的活性，Ca2+能够增强果胶酶活性。本文中的菌株具有较高的果胶酶活性，将进一步利用该菌株对香蕉假茎进行脱胶处理，以期提取出香蕉纤维。

致谢：大连工业大学的何连芳教授级工程师对本论文实验进行了悉心指导，对此表示衷心的感谢。

[1] Jacob P，Prema P. Novel process for the simultaneous extraction and degumming of banana fibers under solid-state cultivation[J].，2008，39（1）：115-121.

[2] Paul S A，Boudenne A，Ibos L，et al. Effect of fiber loading and chemical treatments on thermophysical properties of banana fiber/polypropylene commingled composite materials[J].：，2008，39（9）：1582-1588.

[3] 黄雅婷，何叶丽. 新颖的纺织纤维——香蕉纤维[J]. 印染，2013（21）：54-55.

[4] 蔡勇，韦仕岩，吴圣进，等. 香蕉假茎生物脱胶菌株筛选及其应用效果初探[J]. 南方农业学报，2011，42（08）：944-947.

[5] Mei Y Z，Chen Y R，Zhai R Y，et al. Cloning，purification and biochemical properties of a thermostable pectinase fromM29[J].：，2013，33：77-81.

[6] Soriano M，Diaz P，Pasto F. Pectate lyase C from：A novel endo-cleaving enzyme with activity on highly methylated pectin[J].，2006，152（3）：617-625.

[7] 朱珣之，李强，华楠，等. 磁性氧化石墨烯固定化果胶酶[J]. 化工进展，2014，33（12）：3324-3328.

[8] 张健红，李寅，刘和，等. 一株碱性果胶酶高产细菌的分离、系统发育分析和产酶条件的初步优化[J]. 应用与环境生物学报，2005（3）：354-358.

[9] Kashyap D R，Vohra P K，Chopra S，et al. Applications of pectinases in the commercial sector：A review[J].，2001，77（3）：215-227.

[10] Gummadi S N，Kumar D S. Microbial pectic transeliminases[J].，2005，27（7）：451-458.

[11] 刘龙，汪志浩，张东旭，等. 碱性果胶酶的生物制造及其在纺织工业清洁生产中的应用研究进展[J]. 生物工程学报，2009，25（12）：1819-1828.

[12] 黄小龙，孙焕良，谢达平，等. 亚麻微生物脱胶菌种的筛选与鉴定[J]. 生物学杂志，2004，21（1）：20-22.

[13] 熊元林. 微生物学实验[M]. 武汉：华中师范大学出版社，2008：130-131.

[14] 王俊刚，张树珍，杨本鹏，等. 3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量[J]. 甘蔗糖业，2008（5）：45-49.

[15] 林静，谭晓明，王臻，等. 亚麻纤维脱胶菌的筛选及脱胶效果研究[J]. 生物技术通报，2011（5）：132-136.

[16] Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J].，1959，31（3）：426-428.

[17] 翟秋梅，薛卫巍，薛永常，等. 枯草芽孢杆菌FM208849产果胶酶发酵条件的优化[J]. 大连工业大学学报，2010，29（2）：93-97.

[18] Payasi A，Sanwal R，Sanwal G G. Microbial pectate lyases：Characterization and enzymological properties[J].，2009，25：1-14.

[19] 陈丽娜，应向贤，薛群，等. 细菌碱性果胶酶的酶学特性及其应用研究[J]. 中国生物工程杂志，2010，30（4）：125-130.

[20] Basu S，Roy A，Ghosh A，et al. Arg235 is an essential catalytic residue ofDKS1 pectate lyase to degum ramie fibre[J].，2011，22（1）：153-161.

Isolation，fermentation optimization and enzymatic properties of a pectinase producing strain from banana pesudostem

，，，

（College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

The use of pectianase in natural fiber processing causes less pollution to environment. The key to get pectinase is to isolate a highly producing pectinase strain. A bacterial strain with high production of pectinase had been isolated and screened from banana pesudostem with a selective medium. The phylogenetic analysis based on 16S rDNA showed thatspZLXH-5 was close towith 99% sequence identityIt was named asspZLXH-5. The optimal fermentation condition was as follows，time of 2d，temperature of 37℃，pH value of 5，rotary speed of 180r/min，and glucose concentration of 15g/L. Studies on enzymatic properties showed that optimal temperature for pectinase was 55℃，and optimal pH value for pectinase was 8.5. Different ions showed different impacts on pectinase activity. This strain can be used to process banana pesudostem because of its high pectinase production.

pectinase；fermentation optimation；bio-degumming；banana pesudostem

Q 939.9

A

1000–6613（2015）09–3415–06

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.09.033

2015-01-12；修改稿日期：2015-02-21。

国家自然科学基金（51263006）、教育部博导类专项基金（20134601110004）、海南省国际科技合作专项（KJHZ2014-02）及海南省自然科学基金（314074）项目。

刘长高（1990—），男，硕士研究生。联系人：张玉苍，教授，博士生导师，从事生物质废弃物资源化利用的研究。E-mail yczhang@hainu.edu。