喀斯特地貌中碳酸酐酶微生物鉴定与特性研究

易 哲，叶姜瑜，李大荣， 窦建军， 石玉竹

(1.重庆大学 城市建设与环境工程学院， 重庆 400030；2.重庆融极环保有限公司， 重庆 401120)

喀斯特地貌中碳酸酐酶微生物鉴定与特性研究

易 哲1，叶姜瑜1，李大荣2， 窦建军1， 石玉竹1

(1.重庆大学 城市建设与环境工程学院， 重庆 400030；2.重庆融极环保有限公司， 重庆 401120)

喀斯特地貌；碳酸酐酶；循环冷却水

循环冷却水系统运行过程中由于蒸发浓缩而产生水垢，主要是碳酸盐垢、磷酸盐垢、硅酸盐垢和混合物垢，影响系统的正常换热效率。叶姜瑜等[3]将碳酸酐酶微生物用于处理循环水的水垢，结果表明：碳酸酐酶能溶蚀硬垢且造成其结构疏松，表面被溶蚀为细小的颗粒，溶蚀效果深入到垢样内部。在此基础上，选取具有典型喀斯特地貌的重庆金佛山景区的土壤样本，分离出高产碳酸酐酶菌，选取酶活性最高的一株菌，观察其形态和生理特性，并鉴定其种属。同时，研究了工业循环冷却水的主要环境因子温度、pH值、金属离子、阴离子对高产碳酸酐酶微生物活性的影响，这将为构建高效的循环水微生物阻垢剂提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 样本采集

夏季在金佛山古佛洞溶蚀岩石表面、古佛洞流水洞壁、苔藓覆盖的岩石表面及燕子洞洞口岩石表面取表层土壤作为土样，编号1、2、3、4。

1.2 实验仪器

实验仪器见表1。

表1 实验仪器

1.3 产碳酸酐酶细菌分离与筛选

将4份新鲜土壤样品分别称取3份，制备10-3、10-4、10-5、10-6的稀释菌液，分别将其均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养平板上。挑平板上不同形态和颜色的单菌落，采取分区划线法将其分离培养。在分离细菌的平板上挑取单菌落，采用平板划线进一步纯化。将纯化后的菌种用牛肉膏蛋白胨液体培养基扩培至200 mL，留待后续分析及甘油保种。

纯细菌培养物适量涂布于白垩培养基上，30 ℃ 倒置培养24～48 h。选择能在此固体培养基上生长的细菌，测定其纯细菌培养物的碳酸酐酶活性，从而筛选出能产碳酸酐酶细菌。

1.4 产碳酸酐酶细菌形态观察与生长曲线

采用革兰氏染色法[4]对筛选出的产碳酸酐酶细菌进行染色，并在光学显微镜下观察形态。生长曲线测定：将培养好的种子液，按2 %比例接种到装有牛肉膏蛋白胨培养基中，置于180 r/min摇床中，30 ℃恒温振荡培养，每2 h测OD600值。

1.5 产碳酸酐酶细菌鉴定

用无菌的枪头挑取极少量至少经3次划线纯化的单菌落，洗脱至30.0 μL无菌超纯水中(盛放在PCR管中)作为模板，16S引物采用细菌通用引物8F和1492R[5]。正向引物8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR反应体系为：10×PCR Buffer(不含镁离子)，2.5 μL；MgCl2，1.5 μL；dNTP，2.0μL；上下游引物(10 uM)，各1.0 μL；Taq酶(5 U/μL)，0.4 μL；模板，2.0 μL；用无菌超纯水补足25.0 μL。反应条件为：95 ℃预反应5 min；94 ℃变性1 min；56 ℃反应1 min；72 ℃退火1.5 min，反应循环35次；72 ℃延伸10 min；18 ℃保温60 min。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检验其大小，将PCR产物用TaKaRa DNA凝胶回收试剂盒(D823A)进行纯化。

将纯化产物委托给宝生物工程(大连)有限公司进行测序分析，并将测序结果提交GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，与GenBank数据库中已有细菌的16S rRNA序列进行相似性比对[6]。

1.6 碳酸酐酶的提取与纯化

将细菌培养物在4 ℃、5 000 r/min下冷冻离心10 min，取上清液备用。向上清液中加入一定量的(NH4)2SO4使溶液饱和度达到75 %，此条件下析出的碳酸酐酶的酶量及活性最高[7]，并将其置于4 ℃下盐析12 h。将盐析后的液体在4 ℃、8 000 r/min下冷冻离心30 min，弃上清液，得到蛋白质。将蛋白质沉淀完全溶解于50.0 mmol/L、pH值8.2的HEPES-KOH缓冲溶液中，溶液过G-100葡聚糖凝胶柱，并用100.0 mmol/L、pH值7.5的Tris-H2SO4缓冲液作为洗脱液去洗脱收集粗酶液[8-10]。

1.7 碳酸酐酶活性测定

碳酸酐酶活性参照Brownell[11]等的方法略作改进后测定，该测定方法为：在一个2 ℃的冷冻反应室中，将4.5 mL冰冷的现制CO2饱和水分别加入到0.5 mL煮沸和未煮沸的CA酶液中，并测定其pH值下降一个单位所用的时间。

酶活单位数

U=10(T0/Te-1)

其中：T0为加入煮沸CA酶液组所测得的pH值下降一个单位所需的时间；Te为加入未煮沸CA酶液组所测得的pH值下降一个单位所需的时间。蛋白测定参照Lowry等[12]的方法。碳酸酐酶活性以每mg蛋白含有的酶活单位数(U/mg)表示。

1.8 细菌碳酸酐酶特性研究

1.8.1 细菌碳酸酐酶的热稳定性研究

将从细菌中提取出的碳酸酐酶分别在10、20、30、40、50、60 ℃下处理15、30、60 min，并分别测定处理后的酶活性。

1.8.2 pH值对细菌碳酸酐酶的影响研究

将从细菌中提取出的碳酸酐酶分别在pH 值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5下处理1 h，测定处理后的酶活性。

1.8.3 金属阳离子对细菌碳酸酐酶的影响研究

配置一定浓度的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+金属阳离子溶液，分别与从细菌中提取出的碳酸酐酶以一定比例混合，使混合后的金属离子浓度达到0.001、0.01、0.10、1.00 mmol/L，将混合溶液置于室温下，使其平衡1 h，测定处理后的酶活性。

1.8.4 阴离子对细菌碳酸酐酶的影响研究

2 结果与讨论

2.1 产碳酸酐酶细菌分离与筛选

金佛山风景区是典型的喀斯特地貌，有研究结果表明，夏秋季节土壤中CA活性较高[13]，且表层土壤的微生物种类及土壤活性更高[14]。从土样中共分离出肉眼可见的不同形态菌落的可培养细菌16株。其中有8株菌能在白垩培养基上生长，分别为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8。其中C8菌株在白垩培养基上生长的菌斑特别明显，如图1所示。通过检测菌斑周围水解圈的pH值发现呈弱碱性，所以需确定是由于细菌利用碳酸钙造成的，而不是细菌产酸水解造成的[15]。

图1 菌株C8在白垩培养基上的白垩菌斑

2.2 细菌碳酸酐酶活性测定

分别提取能产碳酸酐酶的8株细菌的碳酸酐酶，测定酶活性，结果如图2所示。

由图2可知：分离出的8株菌均能检测到碳酸酐酶活性，且个体差异明显。其中菌株C8的碳酸酐酶活性最高，达到2.12 U/mg，而C2号菌株的碳酸酐酶活性只有0.20 U/mg，这说明虽然碳酸酐酶普遍存在于原核生物中，但不同种属的菌，其表达程度有很大差异。在此，仅对活性最高的C8菌进行进一步研究。

图2 细菌碳酸酐酶活性

2.3 高产碳酸酐酶细菌形态及生长曲线

C8在固体选择培养基上的菌落形态及革兰氏染色结果见图3。由图3可知：C8菌为革兰氏阳性菌，呈短杆状。其生长曲线如图4所示。由图4可知：大约在18 h C8达到稳定期，以此作为后续提取碳酸酐酶的依据。

图3 C8菌落(A)及革兰氏染色(B：40×100)

图4 菌株C8生长曲线

2.4 高产碳酸酐酶细菌鉴定

对C8菌进行16S rRNA序列分析，用BLAST程序将测序结果与GenBank中的己登录的序列进行相似性分析，得出结果为：菌株C8与Bacillussp.菌的16S rDNA序列有100%的同源性。

2.5 温度对碳酸酐酶稳定性的影响

将Bacillussp.菌的碳酸酐酶置于10、20、30、40、50、60 ℃下分别处理20、40、60 min后，酶的相对剩余活性如图5所示。

图5 温度对细菌碳酸酐酶活性的影响

结果表明：3个处理时间下酶的相对活性变化趋势大致相同，相同温度下，随着处理时间的加长，酶活性有所下降。温度在10～40 ℃时，碳酸酐酶基本能维持较好的活性；超过50 ℃后，酶活下降非常明显，仅处理20 min，就只余下70 %的活性，且随处理时间增多，酶活继续下降。当温度为60 ℃时，只余下30 %的活性。循环冷却水系统管道及换热器中的温度较高，碳酸酐酶处理水垢的效果受到抑制，但是集水池中的温度一般在30 ℃，细菌碳酸酐酶能在其中维持较好的活性[3,16]。

2.6 pH值对碳酸酐酶稳定性的影响

将Bacillussp.菌的碳酸酐酶分别在pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5下处理1 h，处理后的酶活性变化见图6。

由图6可知，碳酸酐酶最适pH值范围是7.0～8.5。过酸过碱的环境都会对其活性有较大影响，如pH值低于6.0时，仅残留10%左右的活性；pH值大于9.5时，活性仅余60%左右。由此可知，碳酸酐酶在pH值为6.8～9.0的循环冷却水中能维持较高活性。

图6 pH值对细菌碳酸酐酶活性的影响

2.7 金属阳离子对碳酸酐酶稳定性的影响

将Bacillussp.菌的碳酸酐酶分别置于浓度为0.001、0.01、0.10、1.00 mmol/L的Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+液中，室温处理1 h，处理后的酶活性变化见图7。

图7 金属离子对细菌碳酸酐酶活性的影响

Zn2+是α-CA金属配位层的活性中心[17-18]，而Fe2+也是β类CA活性中心的组成部分[19]，对碳酸酐酶高效催化CO2水合可逆反应十分重要。由图可知，Fe2+和Zn2+在浓度低于0.01 mmol/L 时，有一定的增强碳酸酐酶活性激活效果，其中Zn2+的增强效果比Fe2+更明显，在浓度0.001 mmol/L时，达到9%。当浓度高于0.01 mmol/L时，Fe2+和Zn2+都抑制了碳酸酐酶活性，但仍维持在65%以上。相反，Ca2+、Mg2+对碳酸酐酶活性则有抑制作用，随浓度升高抑制作用越明显，Mg2+的抑制作用比Ca2+稍强，但处理后都能维持在65%以上的活性。

2.8 阴离子对碳酸酐酶稳定性的影响

图8 阴离子对细菌碳酸酐酶活性的影响

3 结论

1) 从土壤中筛选出来的高产碳酸酐酶微生物为Bacillussp.菌，革兰氏阳性菌，呈短杆状，于18 h达到生长稳定期。

2)Bacillussp.菌的碳酸酐酶能在10～40 ℃维持较高活性，温度高于50 ℃则活性降低了70%；pH值处于7.0～8.5时活性较高，而循环冷却水的pH值一般控制在6.8～9.5，集水池水温与大部分管道的温度一般控制在30 ℃左右，碳酸酐酶能在其中维持较高活性。

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(责任编辑 何杰玲)

Identification and Characterization of Bacterium with Carbonic Anhydrase in Karst Landform

YI Zhe1, YE Jiangyu1, LI Darong2, DOU Jianjun1, SHI Yuzhu1

(1.Faculty of Urban Construction and Environmental Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China；2.Chongqing Rongji Environmental Technology Co., Ltd.，Chongqing 401120，China)

Karst landform；carbonic anhydrase；circulating cooling water

2017-02-17 基金项目：国家科技重大专项(2013ZX07104004)

易哲(1991—)，男，硕士研究生，主要从事环境工程微生物学研究；通讯作者 叶姜瑜(1963—)，男，四川人，博士，副教授，博士生导师，主要从事环境工程微生物学研究，E-mail：yejy8888@163.com。

易哲，叶姜瑜，李大荣，等.喀斯特地貌中碳酸酐酶微生物鉴定与特性研究[J].重庆理工大学学报(自然科学)，2017(8):113-119.

format：YI Zhe, YE Jiangyu, LI Darong,et al.Identification and Characterization of Bacterium with Carbonic Anhydrase in Karst Landform[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2017(8):113-119.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2017.08.019

X172

A

1674-8425(2017)08-0113-07