龙葵鲜药对人鼻咽癌细胞CNE-1增殖抑制和凋亡的影响*

徐俊鸿 高卓维 黄景彬 仇志坤 伍志勇

（广州中医药大学附属顺德中医院（佛山市顺德区中医院）· 佛山 528333）

1 材料和方法

1.1 细胞株与试剂

人鼻咽癌细胞CNE-1(由中国科学院提供），细胞培养试剂：胎牛血清（Hyclone，Cat.No.SH30087.01），RPMI-1640 培养基（Hyclone，Cat.No.SH30809.01B），青链霉素（Hyclone，Cat.No. H30010），PBS 磷酸钾缓冲液（Hyclone，Cat.No.SH30256.01B）

1.2 实验用药与仪器实验用药与仪器：实验用药：龙葵鲜药由顺德中医院提供。龙葵鲜药水煎提取液(1g/ml)的制备：取鲜龙葵500g,加水1000m1煎煮，得第一次提取液约500ml;再将其药渣用水700ml煎煮，得第二次提取液约500ml。两次提取液混合，过滤，滤液再加热浓缩至500ml，即得。龙葵鲜药水煎提取液由顺德中医院制剂室制备。仪器：苏州安泰洁净工作台（SWCJ-IFD），低速离心机（中佳，SC3614），倒置光学显微镜（OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2）, 细胞恒温培养箱(Thermo scientific, HERACELL150i) 倒置荧光显微镜生产商：Leica型号：DMI6000B

1.3 实验方法

1.3.1 药物配制及分组 药物过滤除菌，药液配成浓度为1g／ml于-20℃保存，实验时取出用新鲜培养基配成相应的浓度进行给药。实验分组：按龙葵鲜药水煎液浓度分为5mg/ml组、10mg/ml组、30mg/ml组、50mg/ml组和80mg/ml组，对照组不加药。

1.3.2 CNE-1细胞培养 复苏CNE-1细胞。将其用RPMI-1640培养液(含10%胎牛血清青霉素、链霉素100U／ml)于37℃，5%C02饱和湿度培养条件下培养，每隔2～3天换一次液。置倒置显微镜下观察，待细胞取汇合率达80%～90%时，

用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，按1:2～3传代培养或者进行实验。

1.3.3 MTS法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，经消化后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×105 个/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×104个，每个浓度组（5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml）和对照组均做3个复孔。贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测。收集各个时间点的细胞（24h，48h，72h）加入cellTiter96AQ 单溶液细胞增殖检测试剂（Promega，Cat.No.G3582），比例为1/10（即100ul培养液加入10ul 检测液）。

孵育4 小时后，使用KC-100酶标仪读板（波长490），读取OD值数据。抑制率=(1-实验组平均OD值／对照组平均OD值 )×100%。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡/坏死 上述各组细胞培养48h后，将细胞培养板各组的培养基分别转移到15 ml的锥形管中，并置于冰上。用2 ml PBS溶液轻轻洗细胞2次。加入0.5ml 0.25%胰酶（不含EDTA）消化。用预冷的1×结合缓冲液中使得其密度约为1×106细胞/ml。将细胞悬液转移到离心管内，加入1.25 μl Annexin V-FITC后与室温（18-24°C）避光反应15分钟。室温1000×g离心5分钟，去除上清。将细胞用0.5 ml 预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬。加入10 μl Propidium Iodide试剂后，将样本放置在冰上避光保存。室温孵育15分钟，立即用流式细胞仪检测分析。

1.4 统计学方法 实验数据用均数±标准差（±s）表示。采用SPSS 16.0软件，多组计量资料分析采用One way ANOVA，多重比较采用Dunnett’s 法进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 龙葵鲜药水煎液对CNE-1细胞增殖的抑制作用（表1）

在加入龙葵鲜药水煎液24小时后，对照组5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml组的CNE-1细胞平均抑制率分别为0.00%、4.21%、5.88%、7.40%、6.68%和4.43%，各剂量组的平均抑制率与对照组比较，差异均有显著的统计学意义(P<0.05)；各剂量组的的平均抑制率间相合比较，差异无显著统计学意义(P>0.05)。

表1 龙葵鲜药水煎液对CNE-1细胞增殖的影响

在加入龙葵鲜药水煎液48小时后，对照组5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml组的CNE-1细胞平均抑制率分别为0.00%、6.11%、15.00%、19.52%、28.53%和47.60%，CNE-1细胞平均抑制率随着龙葵鲜药水煎液浓度的增高而逐渐增加。各剂量组的平均抑制率分别与对照组比较，均有显著的统计学差异(P<0.05；各剂量组间平均抑制率相互比较，10mg/ml组与30mg/ml组间平均抑制率的差异无显著统计学意义(P>0.05)，其余各剂量组间平均抑制率相互比较，差异均有显著的统计学意义(P<0.05)。

在加入龙葵鲜药水煎液72小时后，对照组5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml组 的 CNE-1细 胞平均抑制率分别为 0.00%、20.87%、27.56%、37.46%、42.14%和59.09%，CNE-1细胞平均抑制率随着龙葵鲜药水煎液浓度的增高而逐渐增加。各剂量组的平均抑制率分别与对照组比较，均有显著的统计学差异(P<0.05)；各剂量组间平均抑制率相互比较，差异均有显著的统计学意义(P<0.05)。

在 5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml这5个浓度组，在不同时间点平均抑制率的由多到少均为：24h<48h<72h，分别比较同一浓度组在24h、48h、72h这3个时间点平均抑制率的差异，其中5mg/ml浓度组在24h和48h的抑制率差异之间无显著统计学意义(P>0.05)，其余同一浓度组在不同时间点平均抑制率之间的差异均有显著的统计学意义(P<0.05)。

2.2 龙葵鲜药水煎液对CNE-1细胞凋亡和坏死的影响：

流式细胞仪检测分析不同浓度龙葵鲜药水煎液与CNE-1细胞凋亡的相关性，CNE-1细胞凋亡率由大到小依次为80mg/ml >50mg/ml >30mg/ml >10mg/ml >5mg/ml >对照组，随着龙葵鲜药水煎液浓度的增加，CNE-1细胞凋亡率相应增多（图1、表2）。不同龙葵鲜药水煎液浓度组与对照组比较，CNE-1细胞凋亡率的差异均有显著的统计学意义(P<0.05)。

CNE-1细胞坏死率由大到小依次为50mg/ml>80mg/ml>10mg/ml >30mg/ml >5mg/ml >对照组（表2），不同龙葵鲜药水煎液浓度组与对照组比较，CNE-1细胞坏死率的差异均有显著的统计学意义(P<0.05)。

图1 流式细胞仪检测分析不同浓度龙葵鲜药水煎液与CNE-1细胞凋亡的相关性

表2 龙葵鲜药水煎液对CNE-1细胞凋亡和坏死的影响

4讨论

鼻咽癌为岭南地区常见头颈部恶性肿瘤。因鼻咽部位的特殊解剖特点，大部分患者就诊是已属晚期。局部晚期鼻咽癌治疗上以放疗为主，根据患者的具体情况应用化疗。尽管调强放疗技术的得以开展的今天，使得鼻咽癌五年生存率也一直徘徊在70%-80%左右[1]。因此，在常规西医治疗的基础上，如何进一步提高疗效，研究发掘民间中药方，具有重大的现实意义。

岭南地区为鼻咽癌的高发区之一。鲜龙葵汤为岭南地区民间治疗鼻咽癌的经验单方。中国古代哲学认为一物治一物。本课题通过研究岭南地区民间经验单方鲜龙葵在体外对人鼻咽癌细胞增殖抑制和凋亡的影响，以期为今后研究鲜龙葵联合西医常规疗法治疗鼻咽癌提供参考。

研究通过MTS法检测龙葵鲜药水煎液对鼻咽癌CNE-1细胞增殖的抑制作用，以及采用流式细胞检测定量和定性地分析龙葵鲜药水煎液对CNE-1细胞凋亡和坏死的影响。研究中发现，各剂量组对CNE-1癌细胞作用24h、48h、72h均抑制CNE-1细胞增殖，而且抑制作用随着用药时间的增加而增强；5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml浓度组在48h、72h时间点均表现为龙葵鲜药水煎液浓度越高，抑制作用越强的趋势，但在用药24h时，药物浓度的高低与抑制趋势的无显著关系。研究表明，不同浓度的药物作用于CNE-1细胞后，CNE-1细胞增殖受到抑制，这一作用随药物浓度的变化而变化，且在一定范围内与用药时间相关，用药时间越长，对CNE-1细胞的抑制越显著。同时，随着给药剂量的增加，48h凋亡的CNE-1细胞也显著增多。

本研究证实了，在体外实验中，龙葵鲜药水煎液能诱导有效抑制CNE-1细胞的增殖和促进胞CNE-1凋亡，从而发挥其抗肿瘤作用。本研究为龙葵鲜药治疗鼻咽癌提供一定的依据。

[1] 马骏.鼻咽癌治疗的研究进展[J].中山大学学报（医学科学版）,2010,31(2):179-185.