山东泰安甜樱桃“花叶病”树体症状观察及病毒检测

王文文，宗晓娟，魏海蓉，王甲威，朱东姿，谭 钺，刘庆忠

(山东省果树研究所/山东省果树生物技术育种重点实验室，泰安 271000)



山东泰安甜樱桃“花叶病”树体症状观察及病毒检测

王文文，宗晓娟，魏海蓉，王甲威，朱东姿，谭 钺，刘庆忠*

(山东省果树研究所/山东省果树生物技术育种重点实验室，泰安 271000)

为了探明山东泰安患有“花叶病”的甜樱桃树体内感染病毒的种类，本研究以嫁接在3种不同砧木上的甜樱桃品种‘红灯’叶片为试验材料，提取植物样本总RNA，采用随机六聚体引物反转录，选取10种甜樱桃病毒作为检测对象，根据各病毒基因组序列设计特异引物，进行RT-PCR检测。结果显示，10种甜樱桃待检病毒中，5种病毒检测结果呈阳性，分别为PNRSV(Prunusnecroticringspotvirus，PNRSV)、PDV(Prunedwarfvirus，PDV)、CVA(CherryvirusA，CVA)、CGRMV(Cherrygreenringmottlevirus，CGRMV)、LChV-2(Littlecherryvirus-2，LChV-2)，各病毒检出率较高。各“花叶病”甜樱桃样品均至少同时感染2种病毒，多病毒复合感染比例较高。

甜樱桃； 花叶病； 砧木； 病毒； 检测

甜樱桃(PrunusaviumL.)是我国发展较快的果树之一，因其上市早、经济效益高，被列为果树生产的重要树种。截至2010年，我国甜樱桃栽培面积约为11万hm2，其中，山东省甜樱桃栽培面积5.0万hm2，约占全国的45.6%，产量22.0万t，约占全国的62.9%[1]，其面积及产量均居全国第一。然而，随着甜樱桃产业的发展，病害日益成为影响产量和品质的关键因素。由于病毒的危害症状与真菌、细菌的不同，加上果农缺少相关的专业知识，往往将其忽略。这样造成病毒在果园内和果园间不断传播，多数甜樱桃果园树体因罹患病毒病引起早衰、死亡，严重缩短了果园的经济寿命[2]。

近年来，山东泰安地区甜樱桃‘红灯’上普遍出现一种病害，发病叶片上形成淡黄绿色至绿色环斑或褪绿斑，有的叶片产生黄绿相间的线纹。当地果农根据叶片症状将其统称为甜樱桃“花叶病”。植株花叶病发病程度不等，有的个别枝条出现症状，有的整株发病，感病植株通常花期推迟，不能坐果，落花落果现象严重，使果树产量和品质受到极大影响。据报道，植物花叶病可能与多种因素有关，产生的症状相似。生理性因素如缺素症和肥水不足，是黄化型花叶病原因之一。缺磷素叶片出现黄绿和深绿相间的花叶，甚至出现紫红、红色的斑块；樱桃缺铁元素幼叶呈黄白色，嫩叶叶脉间失绿，严重时叶脉也变成黄色，叶片出现棕色枯斑，称“黄化病”[3-5]。病理性因素如细菌、真菌、病毒等危害都会使叶片产生花叶，但病状和病征不同。真菌引起的花叶如大樱桃褐斑病，初期在嫩叶上形成具有深色中心的黄色斑，逐渐病斑边缘变厚并呈黑色或红褐色，病斑近圆形、浅黄褐色至灰褐色；其病原菌为丝孢目核果钉孢菌(Passaloracircumscissa)[6]，显微镜下可见菌丝和孢子；细菌引起的花叶病如大樱桃细菌性穿孔病，其病原为甘蓝黑腐黄单胞菌桃穿孔致病型[Xanthomonascampestrispv.pruni(Smith) Dye]，病斑显微镜下可见菌脓溢出；发病初期叶片上出现半透明水渍状淡褐色小点，扩大成紫褐色至黑褐色圆形不规则病斑，边缘角质化，周围有水渍状淡黄色晕环[7-8]。病毒侵染亦能引起甜樱桃“花叶”症状。与缺素症及真菌、细菌性病害不同，病毒侵染引起的花叶症状的突出特点为不均一失绿。据报道，侵染大樱桃的病毒有34种，较为常见的有20种左右，叶片上的主要症状复杂多样，包括失绿黄化、叶脉白化、小叶、花叶、皱缩、穿孔等[9]。引起樱桃花叶症状的病毒也有多种，如樱桃坏死环斑病和皱缩花叶病均由李属坏死环斑病毒(PNRSV)侵染所致。PNRSV 和苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus，ACLSV)复合侵染会引起樱桃坏死线纹病，即在叶片上出现带状的褪绿斑最终坏死[10]。樱桃褪绿环斑病和樱桃黄花叶病均由李矮缩病毒(PDV)危害所致[10-11]，樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)可以引起樱桃绿环斑驳病[12]，樱桃叶斑驳病毒(Cherrymottleleafvirus，CMLV)导致樱桃叶斑驳病[13]，樱桃坏死锈斑驳病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus，CNRMV)产生樱桃坏死锈斑驳病[14]等。甜樱桃病毒病的病毒种类繁多，以上病毒无论是单独侵染还是复合侵染，都可引起植株花叶症状，多病毒复合侵染危害更重，可导致果树绝产绝收[10]。

分子生物学鉴定方法是目前应用最多的技术，此方法比生理学观察准确，比ELISA 灵敏度高，特异性强，且快速、可靠，其中RT-PCR是最简单常用的方法之一。本研究以山东泰安地区嫁接在3种不同砧木上的甜樱桃品种‘红灯’为对象，对具有花叶症状植株的花、叶片及果实等症状表现进行观察记录，以表现花叶症状的叶片为试验材料，利用RT-PCR技术对花叶病病样病毒感染情况进行了初步检测。

1 材料与方法

1.1 供试材料

于山东泰安肥城边院镇甜樱桃生产园，选取以‘吉塞拉7号’(G7)、‘吉塞拉5号’(G5)、‘大青叶’(DQY)为砧木的甜樱桃‘红灯’花叶型叶片样品共12份，以无病毒组培苗作为RT-PCR检测的阴性对照。取材样品以液氮速冻后置于-70 ℃冰箱保存。

1.2 方法与步骤

1.2.1 总RNA的提取

采用北京天根TIANGEN RNA plant plus reagent作为总RNA提取试剂，方法参照试剂盒小量法提取步骤稍做改动，0.1 g植物材料液氮研磨，转至1 mL提取试剂中振荡混匀，室温放置5 min，4 ℃ 12 000 r/min离心1 min，转移上清，加0.1 mL 5 mol/L NaCl、加0.3 mL氯仿，颠倒混匀，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，转移上层水相，加等体积异丙醇，混匀，放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，75%乙醇漂洗沉淀，弃上清，室温晾干沉淀，加适量DEPC-ddH2O溶解混匀，-70 ℃保存。

1.2.2 RT-PCR扩增

反转录试剂盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas (MBI)，取5 μg植物总RNA、1 μL随机六聚体引物(0.2 μg/μL)，加适量DEPC-ddH2O至12 μL，70 ℃变性5 min，冰浴冷却，依次加入4 μL reaction buffer、1 μL ribonuclease inhibitor(20 U/μL)、2 μL dNTP(10 mmol/L)，25 ℃温育5 min，加入1 μL M-MuLV reverse transcriptase，42 ℃温育1 h，70 ℃ 10 min灭活反转录酶。反应完毕后，产物冰上冷却，-20 ℃保存备用。反转录产物适量稀释后用于PCR扩增。

选取李属坏死环斑病毒(PNRSV)、李矮缩病毒(PDV)、樱桃病毒A(CVA)、樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)、樱桃小果病毒-2(LChV-2)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、樱桃锉叶病毒(Cherryraspleafvirus，CRLV)、樱桃叶斑驳病毒(CMLV)、樱桃小果病毒-1(Littlecherryvirus-1，LChV-1)及樱桃坏死锈斑驳病毒(CNRMV)作为检测对象，根据GenBank上公布的上述病毒基因组序列为参照，设计合成的引物序列如表1。

表1 RT-PCR检测引物

选取相应引物用于各病毒的检测，反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 10 min。PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR产物克隆测序

PCR产物连接至pMD 18-T vector(TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR筛选阳性菌落，提取质粒，酶切鉴定后样品送Invetrogen公司测序，序列分析采用DNAMAN软件。

2 结果与分析

2.1 甜樱桃花叶病症状

以山东省泰安市肥城边院镇甜樱桃生产示范园作为田间症状观察地点，对果园内甜樱桃品种‘红灯’花叶病症状进行观察记录。据观察，植株从3月底至4月初尚未完全展叶时即可发病，至5月底-6月上旬症状表现达到高峰。花叶型叶片无萎蔫腐烂现象，病斑表面未见霜状或粉状霉层，表面无菌脓或黄色晕圈。在早春尚未完全展叶时叶片上可见黄绿相间的花叶斑驳病斑，随着叶片展开，病斑出现褪绿黄化现象，伴随有叶片皱缩、凸起及缺刻症状。有的叶片次脉周围出现淡黄绿色至浅绿色的带纹、环斑和褪绿斑，后期环斑内部组织坏死脱落，出现穿孔。感病植株整体生长迟缓，花朵小而少，结果量少，果实偏小，落花落果现象严重(图1)。冬季叶片花叶症状出现隐症现象，保护地栽培中发病较重。

图1 甜樱桃花叶病田间症状Fig.1 Field symptoms of sweet cherry trees suffering from mosaic disease

2.2 RT-PCR鉴定

提取叶片总RNA，以随机六聚体引物反转录的cDNA第一链为模板，选取各病毒的特异性检测引物进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示(图2)，10种甜樱桃待检病毒中，5种病毒检测结果呈阳性，分别为PNRSV、PDV、CVA、CGRMV、LChV-2；3种不同的砧木样品中都有病毒检出，花叶型样品均至少同时感染2种病毒，多病毒复合感染比例较高，病毒组合与叶片症状表型无明显对应关系。例如，1、2号为以G5为砧木的褪绿斑驳型甜樱桃样品，7～12号为以G7为砧木的黄绿相间带纹花叶型甜樱桃样品，却同时感染PNRSV、PDV、CVA、CGRMV、LChV-2 5种病毒；3～6号同为DQY砧木的样品，植株叶片都出现坏死环斑症状类型，但感染病毒组合类型却不尽相同。然而，不同砧木类型，不同花叶症状类型的叶片均同时感染CGRMV和LChV-2。花叶病甜樱桃样品中，嫁接砧木差异与其病毒感染情况并无规律性可循，说明病毒危害与砧木类型无明显相关性。各病毒的检出率都在83.3%以上，说明花叶病危害植株体内普遍存在病毒感染(表2)。为进一步验证该检测的准确性，将各病毒检测的PCR片段连接至克隆载体pMD18-T vector，克隆测序，序列结果与GenBank中各病毒基因组序列相应区段比对，同源性皆在91%～99.27%之间。以上结果表明，皱叶型甜樱桃树体至少感染5种病毒，而病毒组合类型与叶片症状、砧木类型无明显对应关系。

图2 3种不同砧木的甜樱桃品种‘红灯’花叶病树体内5种病毒的RT-PCR检测Fig.2 RT-PCR detection of 5 viruses in sweet cherry samples on three different rootstocks

砧木类型Rootstock样品数Numberofsamples病毒VirusPNRSVPDVCVACGRMVLChV⁃2G5222222G7666666DQY423244病毒检出率/%Virusdetectionrate83．391．683．3100100

3 讨论

植物花叶病与多因素相关，但各因素产生的花叶病症状却不尽相同。本试验根据各因素产生的症状差异排除叶片感染真菌和细菌的可能[3-8]。据观察，田间叶片皱缩，多黄绿相间的斑驳花斑，严重的出现线纹、带纹或褪绿环斑，与文献记录的病毒病症状相似[9]。

试验选取文献报道较多、与花叶相关的10种甜樱桃病毒为鉴定对象，以嫁接3种不同砧木类型的花叶型‘红灯’样品为材料进行RT-PCR鉴定。结果显示，感病样品5种甜樱桃病毒检测呈阳性，且多为病毒复合侵染。进一步分析发现，不同病毒侵染组合与花叶病的不同症状类型、不同砧木类型并无直接相关性。检出结果显示，PNRSV、PDV、CVA检出率均较高。据报道PNRSV可导致大樱桃坏死环斑病和皱缩花叶病，叶片皱缩，出现坏死环斑，后期病斑内部脱落形成穿孔，严重时植株整株枯死，造成绝产[10]；PDV可引起大樱桃褪绿环斑病和叶片黄化病，植株产生淡绿色斑点或黄绿相间斑驳，叶脉透明，叶略有皱缩[11]；CVA为我国近来发现的一种侵染樱桃的潜隐性病毒，危害症状不明显[16]，但CVA经常和樱桃小果病毒等其他病毒复合侵染，使果实产量和品质明显下降[17]，以上症状描述均与观察结果相符。另外，各样品均同时感染CGRMV及LChV-2。关于CGRMV对植物的危害尚无明确结论[18]。而LChV-2是樱桃小果病的致病原之一，可导致果实发育不完全、糖度降低、上色不均匀等，严重影响甜樱桃的经济性状[19-20]。具有花叶病症状的甜樱桃植株通常果实败育或坐果率不高，推测与感染LChV-2有关。

本研究结合症状观察与分子生物学检测方法，首次对山东泰安地区嫁接在3种不同砧木上的甜樱桃品种‘红灯’花叶病病样病毒感染情况进行了调查，对当地花叶病树体的症状进行记录，初步探明泰安地区甜樱桃“花叶病”树体内确有病毒存在。花叶病植株体内有多种病毒存在，树体花叶类型不同可能与体内不同病毒种类的复合侵染相关，病毒复合侵染加重了对甜樱桃植株的危害。但关于以上病毒单独或复合侵染甜樱桃是否会引起花叶病，还需要通过试验证实。接下来我们会进一步进行病毒回接试验，根据科赫氏法则，结合病毒在草本指示植物及木本指示植物上的症状表现，做出最终的判定，为花叶病的分子生物学鉴定及综合防治提供可靠的科学依据。由于目前病毒病传播快，危害严重，而无有效的药物防治，因此，对果园实行检疫、对病株及时隔离和疏除、嫁接接穗选用无毒材料是当前最有效防治措施。而花叶型叶片可能作为甜樱桃感染病毒病的指示性症状，为今后病害类型的快速诊断奠定基础。

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Symptom and detection of the virus causing mosaic disease in sweetcherry trees in Tai’an, Shandong

Wang Wenwen, Zong Xiaojuan, Wei Hairong, Wang Jiawei, Zhu Dongzi, Tan Yue, Liu Qingzhong

(Shandong Institute of Pomology, Key Laboratory for Fruit Biotechnology & Breeding of Shandong Province, Tai’an 271000, China)

In order to identify the virus causing the sweet cherry mosaic disease in Tai’an, Shandong Province, leaf samples of sweet cherry cultivar ‘Red Lamp’ showing mosaic symptoms on different rootstocks were selected as the materials for total RNA extraction. Reverse transcription was carried out using random hexamer primer for cDNA synthesis. Specific primers were designed according to the genome sequences of each of the 10 sweet cherry viruses and used for RT-PCR detection. The results indicated that 5 virus species were detected positive, including PNRSV, PDV, CVA, CGRMV and LChV-2. All of the mosaic leaf samples were infected with 2 or more virus species. Mixed infection with various viruses was in a large proportion.

sweet cherry； mosaic disease； rootstock； virus； detection

2014-03-10

2014-06-13

公益性行业(农业)科研专项(201203075)；“十二五”国家科技支撑计划(2013BAD02B03-3-2)；山东省现代农业产业技术体系水果创新团队专项基金(2014)

S 436.629

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.02.017

* 通信作者 E-mail： qzliu001@126.com