大鼠急性心肌梗死后期血清代谢轮廓研究

董志欢，李彤，张磊，杨帆

专题研究·代谢病

大鼠急性心肌梗死后期血清代谢轮廓研究

董志欢1，李彤2△，张磊2，杨帆1

目的建立急性心肌梗死（AMI）大鼠血清代谢轮廓模型，探寻对AMI预后及并发症具有临床治疗价值的特征代谢物。方法选取健康雄性Wistar大鼠20只，随机平均分为对照组和AMI 1周组。AMI 1周组进行冠状动脉前降支结扎，建立AMI模型，1周后心脏取血处死。利用代谢组学研究平台对大鼠的血液样本进行代谢轮廓分析，建立大鼠AMI后血液的正交偏最小二乘判别模型及主成分分析模型，结合SPSS 19.0软件的数据处理最终得到特征代谢产物。结果成功建立了主成分分析模型及正交偏最小二乘判别模型，同时从模型中筛选并鉴定了27种在AMI 1周组与对照组具有差异的特征代谢物，在这27种特征代谢物中溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺等差异明显。结论构建的代谢轮廓模型很好地拟合了AMI后期大鼠机体的代谢紊乱状态，筛选出的特征代谢产物可为该疾病治疗以及并发症的预防等提供参考和帮助。

心肌梗死；大鼠,Wistar；色谱法,高压液相；质谱分析法；血清代谢组学

急性心肌梗死（AMI）是由于冠脉的某种原因造成心肌的急性缺血坏死，因其发病突然，病情急剧，往往造成严重的后果。近些年来伴随着人们生活水平的提高和生活方式的转变，我国AMI发病率逐渐升高［1］，随着对AMI研究的深入和医学技术的发展，虽然在一定程度上降低了AMI的死亡率，但其后期的并发症给患者及社会造成较大的负担。代谢组学是一种定量描述生物体内动态参数变化的一门新的组学技术，能反映机体疾病的动态变化，且在肝脏等临床疾病的动态研究中已经取得了较大的进展［2-4］。本研究利用代谢组学的研究平台构建疾病区分模型，筛选AMI后期特征代谢产物，为AMI预后期并发症的早期预防和并发症的治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料正常雄性Wistar大鼠20只，SPF级，体质量

225～250 g，购自北京维通利华实验动物有限公司。甲酸、乙腈、甲醇购自德国Merck KGaA公司，均为HPLC纯；vevo 2100 view高分辨率小动物超声系统（英国sonic公司）；低温高速离心机Multifoge X1R型、Accela超高效液相色谱仪、LTQ Orbitrap XL质谱仪（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组将大鼠按随机数字表法分为AMI 1周组、对照组，各10只。

1.2.2 模型制备参照Watson等［5-6］的方法并加以改进。大鼠禁食10 h后，称质量，3%戊巴比妥钠（100 μL/100 g体质量）腹腔注射麻醉，然后进行开胸手术，辅助通气，快速进行冠状动脉前降支的结扎，以结扎部位以下心肌发白、颜色变浅为手术成功指征，最后缝合关胸。术后进行超声心动检查，观察大鼠心梗状况，正常组心脏前后壁收缩正常，心梗组前壁收缩明显减弱甚至消失，结合射血分数等作为入选标准，见图1。排除术中死亡及术后感染因素，最终筛选1周生存期心梗模型大鼠6只作为研究对象，同期饲养健康组大鼠排除意外死亡及感染等因素，选取体质量与心梗模型大鼠接近的健康大鼠6只作为对照。

1.2.3 标本的采集和预处理AMI 1周组术后1周处死，采集血液，静置50 min后离心提取血清，将上清液中加入3倍体积的甲醇沉淀蛋白，置10 min后，4℃10 000 r/min，离心30 min，将得到的上清液真空离心蒸干得干粉，然后以等样本体积的水与乙腈混合溶液（5%乙腈）重新溶解，上样。

1.2.4 样本分析参照本中心张立等［7］处理方法：质谱系统为LTQ Orbitrap XL杂交质谱，结合正离子扫描模式，离子源电压4.5 kV，毛细管电压30 V，锥孔电压150 V，去溶剂化温度设定为350℃，辅气流速5 arb（99.999%氮气），鞘气流速为30 arb（99.999%氮气）。数据采集贯穿20 min的色谱洗脱，质谱分辨率设定为100 000，采集范围在质核比（m/z）50～1 000。二级质谱检测采用碰撞诱导解离模式（CID），碰撞气为高纯氦气（99.999 9%），能量设定在35（标准化碰撞能量）。液相色谱系统为Accela超高效液相色谱系统，色谱柱为Thermo Hypersil GOLD反相C18柱（2.1 mm i.d.×50 mm. 1.9 μm）。色谱洗脱方式为二元溶剂梯度洗脱，流动相B为0.1%甲酸乙腈混合溶液，流动相A为0.1%甲酸水溶液，色谱洗脱过程为15 min，进样量为10 μL，自动进样器温度设定在4℃，进样后流动相流速设定200 μL/min，色谱柱温设定在20℃，起始梯度为5%，流动相B维持2.5 min，从2.5 min至8.5 min将流动相B线性增至95%，维持此梯度3 min后迅速将其降至5%，此后维持该梯度组成3.5 min以平衡色谱柱。

1.2.5 数据预处理将得到的数据输入MZmine 2.0［8］软件进行数据前处理，提取离子色谱峰强度信噪比S/N＞30，m/z值偏差不超过±0.02的方法进行峰的识别等预处理。以SIM⁃CA-P+12.0.1.0［9］进行数据分析。通过构建主成分分析（PCA）和具有监督模式的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型［10］，初步筛选出具有潜在的可能性的产物。

1.3 统计学方法实验数据输入SPSS 19.0统计软件进行两个独立样本的非参数检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

Fig.1Cardiac echocardiography of rats图1 超声心动图

2 结果

2.1 数据的总离子流图和质控分析以AMI和正常血清样本为依托，结合超高效液相色谱与质谱连用系统平台成功得到标本的总离子流图（TIC），见图2。经过MZmine软件处理AMI1周组与对照组血清标本后，共提取出442个代谢产物。

实验过程中通过质控液在系统中的具体表现评估超高效液相色谱与质谱连用系统的稳定性［11］，对实验过程中15个质控溶液的数据进行主成分分析后得到1个拥有2个主成分的PCA模型：模型参数为R2X=43.3%，Q2=18.8%，其在上样顺序（Num）及第一主成分（t［1］）上的打分图，见图3。可以看出系

统通过前8个逐渐达到平衡，后7个样本穿插在12个样本中，结果没有出现界外值，可见系统在整个实验过程中是稳定的。根据文献提出的超高效液相色谱与质谱连用系统平台可重复性的合格标准［12］，本实验穿插于15个样本分析过程中的质控样本全部合格，可靠的离子峰分布在81.2%到95.3%之间，合格质控品比例为100%，可以认为本批样品分析结果可靠。

2.2 代谢轮廓对疾病的区分能力将进行预处理后的数据结果输入SIMCA软件中建立PCA模型，该模型具有2个主成分，模型参数为R2X=55.7%，Q2=27.1%。其在第一（t［1］）第二（t［2］）主成分上的打分图显示，该模型在第一主成分上（x轴方向）具有一定的区分聚类趋势，且模型没有界外值出现，表明仪器系统在分析过程中能够保持稳定，无偏倚性，见图4A。同时构建了OPLS-DA模型，该模型拥有1个预测主成分及8个正交主成分，模型参数为R2X=97.2%，R2Y=100%，Q2=97%，该模型在第一预测主成分（t［1］）与第一正交主成分（t0［1］）上的打分图，见图4B。其在第一预测主成分方向具有很好的区分聚类趋势，该模型仅有的1个预测主成分能够代表左冠状动脉前降支血供丧失，导致心肌梗死所造成大鼠预后期血清代谢轮廓改变。

Fig.2Total ion chromatogram of serum metabolic profile图2 总离子流图

Fig.3Score plot of the principal component（t［1］）in quality control principal component analysis.（Each point represents a quality control sample.）图3 质控溶液PCA模型第一主成分（t［1］）的打分图（每个点代表1个样本）

Fig.4The metabolic profile of serum samples图4 血清样本代谢轮廓模型

2.3 特征离子的筛选和鉴定首先根据构建的OPLS-DA模型中各代谢离子的影响权重（VIP）值筛选特征离子，选取VIP＞1的离子中排除置信区间和系数图上包含零的变量，同时结合载荷图筛选出同时具有较高的可靠性和较大的变化程度的离子，利用SPSS 19.0软件进行非参数检验，最后得到63个

特征代谢产物。

部分特征代谢物经标准品比对得到鉴定结果，无标准品进行比对的代谢物鉴定参照文献报道的方法［13-14］，首先利用差异代谢物精确m/z值查找人类代谢组数据库（HMDB,http://hmdb.ca/），按照m/z数值的偏差不超过0.01的原则，结合准确的电荷数与相符的电离方式对检索的结果进行校验。同时将得到的二级质谱图与Thermo Fisher数据库Mass Fronti⁃cr 6.0得到的HMDB鉴定的结果进行比对，Ion trap质谱CID模式下产生的碎片与理论碎片比对不超过0.2，理论碎片应与特征离子的三强峰匹配符合。而且80%的二级质谱碎片峰能够覆盖特征离子。有鉴定结果的特征代谢物共计27个，且在2组间差异均有统计学意义，见表1。

Tab.1The screened results of significant metabolites表1 特征代谢物鉴定结果

3 讨论

本研究成功构建了AMI大鼠预后生存模型，并对筛选出的特征代谢物进行分析，发现这些物质主要与脂类、氨基酸类等代谢有关，特别是与细胞膜的代谢关系密切。本研究结果显示7种溶血磷脂酰胆碱（LPC）类物质与对照组比较呈明显增高趋势，该类物质主要是与细胞膜的水解代谢有关，在正常的血液中很少，但是据文献报道其在心肌组织缺血、缺氧时水平会明显增加［15］，LPC在血液中相对于对照组增高明显，应该与AMI预后期心肌细胞坏死导致细胞膜水解破坏后大量释放于血液中有关。LPC水平的增高会给机体带来巨大的危害，相关研究发现LPC参与心血管内皮的损伤以及炎症反应，最终导致血管硬化［16］。大量的LPC储存在体内还会引起心肌细胞膜的电信号紊乱，引发严重的心律失常，进而影响心肌的收缩功能［17］，临床表现为AMI患病期间常伴随不同程度的心电生理信号改变，进而发生室速及室颤等高危症状，因此提示临床工作者应将LPC作为心梗疾病不良预后结果的监测指标。

溶血磷脂酸（LPA）类物质与多种心血管疾病有关［18］，其水平高低和LPC有直接的关系。有文献报道LPC在体内可以转化成LPA，并且LPA可以在一定程度上反映机体患血栓性疾病的风险［19］。本研究显示心梗1周组LPA较对照组大量增高，提示存在血栓的风险，与临床上AMI患者后期再次发生各种血栓事件相符，LPA可以作为AMI患者二次血栓的风险因子。

溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）是磷脂酰乙醇胺（PE）的代谢产物之一，主要通过磷脂酶A2水解PE而产生［20］。在正常情况下体内水平较低，本研究显示LPE水平的大量增加应与AMI过程中长时间缺血缺氧致细胞代谢紊乱相关。LPE还会影响细胞间信号传导，特别是钙离子通道［21］，进一步影响心肌的收缩功能。

除此之外，值得关注的是脯氨酰-酪氨酸、L-苯丙氨酸、脑酮酸、山嵛酸、1-溶血-2-花生四烯酰磷脂、脱氧腺苷等特征代谢物在心梗1周组相对于对照组呈显著增高趋势，这些变化主要反映AMI大鼠氨基酸、脂类、腺苷等代谢紊乱。心梗后心肌组织中

存在超负荷的氨基酸代谢［6］，心梗发生初期氨基酸类的代谢紊乱应该引起临床重视。脱氧腺苷是嘌呤代谢产物的一种，与机体炎症反应相关，其水平升高会使心梗患者并发感染的概率增大［22］，对此类产物进行临床监测可以为AMI的诊断与后期并发症防治提供帮助。

综上所述，对于AMI血清代谢轮廓的研究并对特征代谢物代谢途径进行分析，可为临床改善AMI预后及并发症防治提供新的思路。

［1］Zhang XF,Hu DY,Ding RJ,et al.Status and trend of cardio.cere⁃bral.vascular diseases mortality in China：data from nailonaI dis⁃ease surveillance system between 2004 and 2008［J］.Chin J Cardiol, 2012,40（3）:179-187.［张啸飞,胡大一,丁荣晶,等.中国心脑血管疾病死亡现况及流行趋势［J］.中华心血管病杂志,2012,40（3）: 179-187］.doi:10.3760/cma.j.issn.0253-3758.2012.03.002.

［2］Cao H,Huang H,Xu W,et al.Fecal metabolome profiling of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma patients by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta, 2011,691（1-2）:68-75.doi:10.1016/j.aca.2011.02.038.

［3］Chen T,Xie G,Wang X,et al.Serum and urine metabolite profiling reveals potential biomarkers of human hepatocellular carcinoma［J］. Mol Cell Proteomics,2011,10（7）:M110-M4945.doi:10.1074/mcp. M110.004945–1

［4］Soga T,Sugimoto M,Honma M,et al.Serum metabolomics reveals gamma-glutamyl dipeptides as biomarkers for discrimination among different forms of liver disease［J］.J Hepatol,2011,55（4）:896-905.

［5］Watson LJ,Facundo HT,Ngoh GA,et al.O-linked-N-acetylglu⁃cosamine transferase is indispensable in the failing heart［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107（41）:17797-17802.

［6］Sansbury BE,DeMartino AM,Xie Z,et al.Metabolomic analysis of pressure-overloaded and infarcted mouse hearts［J］.Circ Heart Fail, 2014,7（4）:634-642.doi:10.1161/CIRCHEARTFAILURE.114.001151.

［7］Zhang L,Ma YN,Zhang L,et al.Serum metabolic profiling and screening of characteristic metabolites before and after partiM hepatectomy for HBV-related liver cancer［J］.Chin J Hepatobiliary Surg,2013,19（2）:81-87.［张立,马亚楠,张磊,等.乙肝相关性肝癌手术前后血清代谢轮廓分析及特征代谢物筛选［J］.中华肝胆外科杂志,2013,19（2）:81-87］.doi：10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2013.02.001.

［8］Feng S,Du YQ,Zhang L,et al.Analysis of serum metabolic profile by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry for biomarkers discovery:application in a pilot study to discriminate pa⁃tients with tuberculosis［J］.Chin Med J（Engl）,2015,128（2）:159-168.

［9］Wang B,Chen D,Chen Y,et al.Metabonomic profiles discriminate hepatocellular carcinoma from liver cirrhosis by ultraperformance liquid chromatography–mass spectrometry［J］.J Proteome Res, 2012,11（2）:1217-1227.doi:org/10.1021/pr2009252.

［10］Wang J,Li Z,Chen J,et al.Metabolomic identification of diagnostic plasma biomarkers in humans with chronic heart failure［J］.Mol Bio⁃syst,2013,9（11）:2618.doi:10.1039/c3mb70227he.

［11］Gika HG,Theodoridis GA,Wingate JE,et al.Within-day reproduc⁃ibility of an HPLC-MS-Based method for metabonomic analysis: application to human urine［J］.J Proteome Res,2007,6（8）:3291-3303.

［12］Dunn WB,Broadhurst D,Brown M,et al.Metabolic profiling of se⁃rum using Ultra Performance Liquid Chromatography and the LTQOrbitrap mass spectrometry system［J］.J Chromatogr B Analyt Tech⁃nol Biomed Life Sci,2008,871（2）:288-298.

［13］Liu S.Human liver tissue metabolic profiling research on hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol, 2013,19（22）:3423.doi:10.3748/wjg.v19.i22.3423.

［14］Huang S,Xu F,Lam SH,et al.Metabolomics of developing zebraf⁃ish embryos using gas chromatography-and liquid chromatogra⁃phy-mass spectrometry［J］.Mol Biosyst,2013,9（6）:1372.doi: 10.1039/c3mb25450j.

［15］Yu L,Netticadan T,Xu Y J,et al.Mechanisms of lysophosphatidyl⁃choline-induced increase in intracellular calcium in rat cardiomyo⁃cytes［J］.J Pharmacol Exp Ther,1998,286（1）:1-8.

［16］Mannheim D,Herrmann J,Versari D,et al.Enhanced Expression of Lp-PLA2 and Lysophosphatidylcholine in Symptomatic Carotid Atherosclerotic Plaques［J］.Stroke,2008,39（5）:1448-1455.doi: 10.1161/STROKEAHA.107.503193.

［17］Zheng MQ,Liu L,Tian L.The effects of lysophosphatidylcholine on T-type Ca2+channel and its intracellular modulation mechanisms［J］. Chin J Heart&Heart Rhythm,2013,1（1）:24-26.［郑明奇,刘刚,田立.溶血磷脂酰胆碱对T型钙离子通道的心肌细胞内信号调控机制［J］.中华心脏与心律电子杂志,2013,1（1）:24-26］.doi：10. 3877/cma.j.issn.2095-6568.2013.1.013.

［18］Ishii I,Fukushima N,Ye X,et al.LYSOPHOSPHOLIPID RECEP⁃TORS:Signaling and Biology［J］.Annu Rev Biochem,2004,73（1）: 321-354.doi:10.1146/annurev.biochem.73.011303.073731.

［19］Khandoga AL,Pandey D,Welsch U,et al.GPR92/LPA5 lysophos⁃phatidate receptor mediates megakaryocytic cell shape change in⁃duced by human atherosclerotic plaques［J］.Cardiovasc Res,2011, 90（1）:157-164.doi:10.1093/cvr/cvq369.

［20］Wang C,Feng R,Li Y,et al.The metabolomic profiling of serum in rats exposed to arsenic using UPLC/Q-TOF MS［J］.Toxicol Lett, 2014,229（3）:474-481.

［21］Park KS,Lee HY,Lee SY,et al.Lysophosphatidylethanolamine stimulates chemotactic migration and cellular invasion in SK-OV3 human ovarian cancer cells:Involvement of pertussis toxin-sensi⁃tive G-protein coupled receptor［J］.FEBS Letters,2007,581（23）: 4411-4416.

［22］Zang L,Gao J,Zhang FM,et al.Investigation of serum metabolic pro⁃filing in acute myocardium infarction［J］.Chin J Lab Med,2013,36（11）:1022-1026.［张立,高洁,张凤美,等.急性心肌梗死患者血清代谢物谱的筛选研究［J］.中华检验医学杂志,2013,36（11）:1022-1026］.doi:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2013.11.013.

（2015-03-30收稿 2015-05-07修回）

（本文编辑 李国琪）

Investigation of serum metabolic profiling in late-stage of acute myocardium infarction in rats

DONG Zhihuan1,LI Tong2△,ZHANG Lei2,YANG Fan1
1 The Third Central Clinical College of Tianjin Medical University，Tianjin 300170，China；2 Tianjin Third Central Hospital△

ObjectiveA serum metabolic profiling in acute myocardial infarction（AMI）rat was established to screen potential metabolic markers of AMI prognosis and complication.MethodsMale Wistar rats（n=20）were divided randomly into AMI 1 week group and control group.Anterior descending coronary was ligated in rats in AMI 1 week group to establish AMI model.After one week,these rats were sacrificed and the blood was collected from heart.And metabolomics platform was used to analyze serum metabolic profile.After PCA（principal component analysis）and OPLS-DA（Orthogonal partial least squares-Discriminant Analysis）were established,SPSS 19.0 was used to analysis data to get the potential metabolic markers.ResultsThe PCA and OPLS-DA were established successfully and 27 metabolites present differently in levels between AMI 1 week group and the control group.Among these metabolites,LysoPC（lysophosphatidylcholine）and LysoPE（lysophosphatidyl ethanolamine）demonstrate significant differeance between these two groups.ConclusionThe metabolic disorder in AMI patients can be reflected from the serum metabolic profiling.And these significant metabolites provide sup⁃port and reference for the prevention of AMI complication and its treatment.

myocardial infarction；rats,Wistar；chromatography,high pressure liquid；mass spectrometry；serum me⁃tabolomics

R541.4

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.022

天津市自然科学基金资助项目（10JCYBJC14000）

1天津医科大学三中心临床学院（邮编300170）；2天津市第三中心医院

董志欢（1989），男，硕士研究生，主要从事心血管代谢研究

△通讯作者E-mail:Litongtj@163.com