黄芪提取物对大鼠骨髓源性内皮祖细胞的作用

刘暖，毛秉豫，杨雷，徐国昌，叶松山，张培华，张瓅芳

黄芪提取物对大鼠骨髓源性内皮祖细胞的作用

刘暖，毛秉豫，杨雷△，徐国昌，叶松山，张培华，张瓅芳

目的探讨黄芪提取物对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）黏附、迁移、活力、血管形成能力及内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表达的影响。方法体外培养、分离和鉴定EPCs，设10-4、10-3、10-2g/L黄芪提取物组和对照组。倒置显微镜下观察并比较各组EPCs黏附、迁移、血管形成能力的差异；MTT法检测EPCs的活力变化；RT-PCR法检测EPCs中eNOS mRNA的表达；Western blot检测EPCs中eNOS蛋白的表达。结果与对照组相比，不同浓度黄芪提取物组促EPCs黏附、迁移、血管形成能力均显著增强，且呈浓度依赖性（F值分别为15.256、13.633、97.549，均P＜0.05）；EPCs的活力显著增加，呈时间（F时间=9.755）和浓度依赖性（F组间=10.018）；且EPCs中eNOS mRNA和蛋白的表达水平均明显升高，呈浓度依赖性（F值分别为56.356、77.125，均P＜0.05）。结论黄芪提取物具有调控EPCs促血管新生的作用，该作用可能与上调eNOS的表达水平密切相关。

黄芪；骨髓祖代细胞；细胞黏附；细胞运动；内皮祖细胞；血管新生；内皮型一氧化氮合成酶

骨髓源性内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）在缺氧、生长因子、炎症因子及趋化因子的作用下，可以从骨髓中动员进入循环，进而进入损伤部位分化为成熟的内皮细胞，并通过旁分泌的方式调控现存的内皮细胞，以一种和胚胎时期血管形成相似的方式分化成为血管内皮细胞，进一步形成血管，参与缺血性心血管系统疾病损伤的修复进程，是当前促血管新生疗法的研究热点之一［1］。本课题组前期研究证实，黄芪可明显改善大鼠心肌梗死后异常的血液流变学指标、组织病变，并具有促血管新生的作用［2］。有研究表明黄芪可明显促进外周血EPCs的黏附、迁移［3-4］。但有关黄芪对大鼠骨髓源性

EPCs的作用，及黄芪促血管新生的作用是否和其对EPCs的作用密切相关尚少见报道。本研究旨在探讨黄芪提取物对大鼠骨髓源性EPCs黏附、迁移、活力和血管形成的作用，并分析其对内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）表达的影响，为黄芪调控EPCs诱导分化为血管内皮细胞，促缺血损伤心肌组织中血管的新生提供体外实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康雄性SD大鼠12只，购自河南省实验动物中心，清洁级，8周龄，体质量约200～240 g，平均（212± 6）g，动物生产许可证号：SCXK（豫）2010-0002，动物质量合格证号：1000142。

1.1.2 药物与试剂黄芪由南阳理工学院方药研究所黄显章副教授鉴定，为豆科植物蒙古黄芪（Astragalus mongholicus Bge.）的干燥根；黄芪提取物由南阳理工学院方药研究所提供，系经水提、大孔吸附树脂纯化所得纯化后的黄芪提取物（astragalus extract，AE）；黄芪总苷的含量为66.9%，批号：2012021。DNA酶Ⅰ、Dulbecco's PBS、FBS、胶原酶Ⅰ购自上海宝曼生物科技有限公司（生产批号分别为LS002004、28374、SH30077、LS004194）；内皮细胞基础培养基（endothe⁃lial basal medium-2,EBM-2）购自北京达科为生物技术有限公司（生产批号为CC-3156）；CD133、CD34、eNOS、血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor recep⁃tor 2,VEGFR-2）抗体购自天津恒业生物科技有限公司（生产批号为EL910835、EL162014、EL163112和EL171852）；羊抗兔IgG、二氨基联苯胺（3，3'-diaminobenzidine,DAB）显色液购自武汉博士德生物工程有限公司（生产批号为TC1378和DD1660）；纤连蛋白（Fibronectin,FN）、异硫氰酸荧光素（fluo⁃rescein isothiocyanate,FITC）和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′, 6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）购自北京碧橙蓝生物科技有限责任公司（生产批号为PA127507、PA185438和62247）；其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器A2-1389型生物安全柜（美国Thermo Sci⁃entific公司）；164-5052型PowerPac HC电泳仪及FACSCan⁃toⅡ型流式细胞仪（美国BIO-RAD公司）；Bullet Blender Storm组织细胞破碎仪（美国Next Advance公司）；Nikon Tis型荧光显微镜及Nikon NIS-Elements Software BR分析系统（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的体外分离、培养和鉴定取SD大鼠，颈椎脱臼处死后，75%乙醇浸泡10 min，无菌操作环境下取出胫腓骨，用含肝素及DNA酶Ⅰ的Dulbecco's PBS反复冲洗骨髓，收集骨髓液，小心置入等量的淋巴细胞分离液中，1 700 r/min离心30 min，无菌毛细吸管吸取分离液中间白膜层，5×PBS重悬细胞，离心后再用含2%FBS的EBM-2培养基重悬，按105个/cm2标准接种于培养板中，24 h后将未贴壁的细胞悬液转入预先用FN（50 mg/L）包被的6孔细胞培养板中培养，每隔3 d换液1次，倒置显微镜下进行细胞形态学观察。7～10 d后，待细胞融合80%后，采用胶原酶Ⅰ消化后传代培养。对培养的内皮细胞观察其生长状态，分别在4、7、10、14 d照相并记录。对新分离的骨髓单核细胞进行滴片，于第4、7、10、14天取生长良好的原代细胞，重悬于PBS中，分别与EPCs细胞表面标志物CD133、CD34、VEGFR-2结合，再行FITC染色，DAPI复染，检测上述标志物阳性表达的细胞。

1.2.2 黄芪提取物对EPCs黏附的影响提前用FN（50 mg/L）包被细胞培养板，每孔接种5×104个EPCs，培养过夜，形成单皮层后转入无血清培养基培养5 h，用钙黄绿素标记EPCs后制备单细胞悬液，37℃下孵育30 min。实验设4组：对照组和不同浓度（10-4、10-3、10-2g/L）黄芪提取物组。每组设6个复孔，实验重复3次。各组干预后，在37℃、5%CO2孵箱中孵育30 min，用PBS轻轻冲洗细胞，去除未黏附细胞，倒置显微镜（×100）下，随机取6个视野拍照，计数黏附细胞个数，取平均值。

1.2.3 黄芪提取物对EPCs迁移的影响用8 μm孔径的24孔transwell进行迁移实验，先分别在细胞小室的上、下室加入50 mg/L的FN包被液，再注入含2%FBS的EBM-2培养基。然后在上室按照2×104个/孔的密度接种EPCs，在下层分别加入10-4、10-3、10-2g/L黄芪提取物，对照组加入等量EBM-2；每组设置3个重复。培养24 h后，用棉签擦去上室内的细胞，2%多聚甲醛固定，Giemsa染色，倒置显微镜（×100）下随机取6个视野，计数迁移过膜的细胞数量，取平均值。

1.2.4 MTT法检测黄芪提取物对EPCs活力的影响将EPCs用含2%FBS的EBM-2的基础培养基重悬，104个/孔加入96孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养。采用MTT法检测EPCs的活力。具体如下：各组细胞分别培养24、48和72 h后，每孔加入5 g/L的MTT孵育4 h后，弃去上清，加入DMSO，震荡10 min后，490 nm处读取光密度（OD）值，每组设8个复孔，实验重复3次，取平均值。

1.2.5 黄芪提取物对EPCs血管形成能力的影响将EPCs用含2%FBS的EBM-2基础培养基重悬，5×104个/孔加入Matrigel-Matrix预处理的48孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养。每组设6个复孔，实验重复3次。培养72 h后，倒置显微镜（×40）下观察各组管状结构，随机取6个视野照相，用Nikon NIS-Elements Software BR分析软件测量血管长度（mm），取其平均值。

1.2.6 RT-PCR法检测EPCs中eNOS mRNA的表达将EPCs用含2%FBS的EBM-2基础培养基重悬，105个/孔加入6孔培养板中，待细胞贴壁后，更换无血清培养基培养。培养24 h后，Trizol法提取EPCs总RNA，根据Genebank序列，分别设计eNOS的上下游引物为5′-CTGCTGCCCCA⁃GATATCTTC-3′和5′-CAGGTACTGCAGTCCCTCCT-3′，产物长度为230 bp。采用RT-PCR法检测EPCs中eNOS mRNA的表达。具体如下：每组细胞取2 μg总RNA，根据试剂盒说明书逆转录合成cDNA，再取2 μg逆转录产物进行普通PCR，94℃1 min；95℃30 s，54℃1 min，72℃1 min，30个循环，72℃延伸2 min。每组设3个复孔，实验重复3次。取反应产物10 μg进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后Alpha View SA软件摄图，并分析eNOS与β-actin基因的灰度比值。

1.2.7 Western blot法检测EPCs中eNOS蛋白的表达细胞培养实验设计同1.2.6，采用Western blot法检测EPCs中eNOS蛋白的表达。具体如下：应用Next Advance Bullet Blender Storm组织细胞破碎仪将EPCs打碎，匀浆，4℃下12 000×g离心2 min，提取组织总蛋白后Bradford法测定蛋白浓度，取其中20 μg蛋白进行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h后洗膜，标记1∶250稀释的eNOS一抗，4℃过夜，洗膜，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀释）孵育1 h后TBST洗膜，冲洗后暗室曝光显影。同时以β-actin蛋白表达水平作为内参对照。每组设3个复孔，实验重复3次。胶片经成像分析系统扫描，并应用AlphaView SA软件分析各样本与β-actin蛋白灰度的比值，记录蛋白相对含量。

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计处理，计量资料以表示，同一时点多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验；不同时点多组间比较采用重复测量设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 EPCs的鉴定EPCs结合FITC后呈现绿色，DAPI复染后胞核呈蓝色。EPCs呈卵圆形、纺锤形或者不规则状，CD133、CD34、VEGFR-2表达阳性，见图1。

2.2 黄芪提取物对EPCs黏附、迁移能力的影响与对照组相比，不同浓度黄芪提取物组促EPCs黏附、迁移的能力均显著增强，且呈浓度依赖性（F黏附= 15.256，F迁移=13.633，均P＜0.05），见图2。

Fig.2Effect of astragalus extracts on migration and adherence in EPCs图2 黄芪提取物对EPCs黏附、迁移能力的影响

2.3 黄芪提取物对EPCs活力的影响（1）组内不同时点比较。各组不同时点OD值差异有统计学意义（F时间=9.755）。与对照组相比，不同浓度黄芪提取物组OD值均随时间变化呈增长趋势（F值分别为5.324、9.626、11.172，均P＜0.05）。（2）各时点组间比较。各组间OD值差异有统计学意义（F组间=10.018）。与对照组相比，各时点10-4、10-3、10-2g/L黄芪提取物组OD值均明显升高，呈浓度依赖性（F值分别为4.134、8.724、12.528，均P＜0.05）。组间和处理时间之间存在交互效应（F交互=13.473，P＜0.05），见图3。

Fig.3Effect of astragalus extracts on Viability in EPCs图3 黄芪提取物对EPCs活力的影响

2.4 黄芪提取物对EPCs血管形成能力的影响与对照组相比，不同浓度黄芪提取物组促EPCs的血管形成能力均明显增强，且呈浓度依赖性（F= 97.549，P＜0.05），见图4。

Fig.4Effect of astragalus extracts on microvascular formation in EPCs图4 黄芪提取物对EPCs血管形成能力的影响

2.5 黄芪提取物对EPCs中eNOS mRNA转录表达的影响与对照组相比，不同浓度黄芪提取物组EPCs中eNOS mRNA的表达水平均明显升高，且呈浓度依赖性（F=56.356，P＜0.05），见图5。

Fig.5Effect of astragalus extracts on mRNA transcription level of eNOS in EPCs图5 黄芪提取物对EPCs中eNOS mRNA转录表达的影响

2.6 黄芪提取物对EPCs中eNOS蛋白表达的影响与对照组相比，不同浓度黄芪提取物组EPCs中eNOS蛋白的表达水平均明显升高，且呈浓度依赖性（F=77.125，P＜0.05），见图6。

Fig.6Effect of astragalus extracts on protein expression levels of eNOS in EPCs图6 黄芪提取物对EPCs中eNOS蛋白表达的影响

3 讨论

EPCs的黏附和迁移是EPCs从骨髓中动员并进入循环，再进入损伤部位分化为血管内皮细胞，进而形成微血管的初始关键步骤和必要条件之一［1］。本研究结果显示，与对照组相比，黄芪提取物可显著促进EPCs的黏附和迁移，且呈浓度依赖性。这可能与黄芪提取物活化细胞间黏附分子l（intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1）和血管细胞黏附分子l（vascular cell adhesion molecule l,VCAM-1）的作用密切相关，ICAM-1和VCAM-1可介导EPCs之间的黏附、趋化因子诱导的EPCs跨内皮的迁移［5］。EPCs增殖过程中的活细胞百分比反映EPCs的活力，决定着EPCs被诱导分化为血管内皮细胞的效率。本研究结果显示，与对照组相比，黄芪提取物可显著增加EPCs的活力，且呈时间和浓度依赖性，提示黄芪提取物可明显提升EPCs分化为血管内皮细胞的效率。另外，黄芪提取物可提升EPCs诱导分化血管的长度，这可能与其提升EPCs诱导生成多种生长因子的作用密切相关，如促进VEGF、基质细胞衍生因子-1、胰岛素样生长因子-1、血小板衍生生长因子等的生成增多，以上生长因子联合发挥作用，在血管新生的进程中扮演着重要角色［6-7］。综合以上结果，黄芪提取物可以明显提升EPCs的黏附、迁移、活力以及血管形成能力，这对于诱导EPCs在缺血受损组织区域内分化为微血管，进而促进缺血性组织损伤的修复发挥着重要的作用。

新生的血管能否保持稳态、避免转化为老化的肉芽组织并发育为成熟的血管组织对于有效的微循环形成起着决定性的作用。eNOS及其产物NO在微血管循环的稳态维持中扮演着重要的角色，并调控着血压水平、血管的紧张度，而且发挥着重要的抗炎、抗氧化、抗血栓形成效应［8］。有研究证实eNOS的转录上调可以显著升高EPCs的表达水平［9］。本研究结果显示，黄芪提取物可上调eNOS的mRNA和蛋白表达水平，且呈浓度依赖性，提示黄芪提取物不仅可以诱导EPCs分化为新生的微血管，而且可以促进新生的微血管发育成熟，从而为缺血受损组织提供有效的微循环，实现真正意义上的血管新生。

（图1见插页）

［1］Liu ZJ,Velazquez OC.Hyperoxia,endothelial progenitor cell mobi⁃lization,and diabetic wound healing［J］.Antioxid Redox Signal, 2008,10（11）:1869-1882.doi:10.1089/ars.2008.2121.

［2］YangL,MaoBY,XuGC,etal.Effectofastragalusextractonthelevels of PKD1 protein in rats with myocardial infarction［J］.Chin Pharmacol Bull,2013,29（4）:512-519.［杨雷，毛秉豫，徐国昌，等.黄芪提取物对大鼠心肌梗死后心肌组织PKD1蛋白表达的影响［J］.中国药理学通报，2013,29（4）:512-519］.doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2013.04.020.

［3］Ji KT,Hu JJ,Chen J,et al.Protective effects of astragaloside on function of EPCs damaged by ox-LDL［J］.Chinese Journal of Mod⁃ern Applied Pharmacy,2013,30（8）:827-832.［季亢挺，胡建坚，陈军，等.黄芪甲苷对氧化低密度脂蛋白诱导内皮祖细胞炎症损伤的保护作用［J］.中国现代应用药学,2013,30（8）:827-832］.doi: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2013.08.008.

［4］Liu Y,Li ZL,Jiang TC,et al.Effects of astragalus polysaccharides on the number and functions of circulating endothelial progenitor cells in patients with type 2 diabetes［J］.China Medical Herald, 2014,11（34）:8-10.［刘毅，李志樑，江腾春，等.黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的影响［J］.中国医药导报,2014,11（34）:8-10］.

［5］Palmefors H,DuttaRoy S,Rundqvist B,et al.The effect of physical activity or exercise on key biomarkers in atherosclerosis-a systemat⁃ic review［J］.Atherosclerosis,2014,235（1）:150-161.doi:10.1016/j. atherosclerosis.

［6］Li XY,Fang J,Zhang HM,et al.Effects of FIZZ1 on promoting an⁃giogenesis in rat aortic endothelial cells and its underlying mecha⁃nism［J］.Med J Chin PLA,2013,38（2）:111-115.［李晓燕，房洁，张红明，等.FIZZ1对大鼠主动脉内皮细胞血管新生的促进作用及其机制探讨［J］.解放军医学杂志,2013,38（2）:111-115］.

［7］Balaji S,King A,Crombleholme TM,et al.The Role of Endothelial Progenitor Cells in Postnatal Vasculogenesis:Implications for Ther⁃apeutic Neovascularization and Wound Healing［J］.Adv Wound Care（New Rochelle）,2013,2（6）:283-295.doi:10.1089/wound.2012.0398.

［8］Förstermann U,Sessa WC.Nitric oxide synthases:regulation and function［J］.Eur Heart J,2012,33（7）:829-837.doi:10.1093/eur⁃heartj/ehr304.

［9］Wang X,Meng H,Chen P,et al.Beneficial effects of muscone on cardiac remodeling in a mouse model of myocardial infarction［J］. Int J Mol Med,2014,34（1）:103-111.doi:10.3892/ijmm.2014.1766.

（2015-04-21收稿 2015-07-16修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Effect of astragalus extracts on bone marrow-derived endothelial progenitor cells in rats

LIU Nuan,MAO Bingyu,YANG Lei△,XU Guochang,YE Songshan,ZHANG Peihua,ZHANG Lifang
Medical Experimental Center，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China△

ObjectiveTo explore the effect of astragalus extracts on adherence,migration,cell viability,microvascular formation,and eNOS expression in bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）of rats.MethodsEPCs were cultured,isolated and identified in vitro and divided into four groups:low titer group（10-4g/L of astragalus extracts）,middle titer group（10-3g/L of astragalus extracts）,high titer group（10-2g/L of astragalus extracts）and control group.The effects of astragalus extract on adhesion,migration or microvascular formation were observed under the inverted microscope and com⁃pared between all groups；Cell viability was detected by MTT assay；mRNA transcription and protein expression levels of en⁃dothelial nitric oxide synthase（eNOS）in EPCs were detected by reverse transcription PCR（RT-PCR）and Western blot re⁃spectively.ResultsCompared with the control group,cell adhesion,migration and microvascular formation of EPCs all en⁃hanced with addition of astragalus extracts in a dose dependent manner（F=15.256,13.633,97.549 respectively,and P＜0.05 in all cases）；Cell vitality of EPCs increased with administration of astragalus extracts in a time and dose dependant manner.（F=9.755 for time and F=10.18 for dose）.mRNA transcription and protein expression of eNOS in EPCs were up-reg⁃ulated with addition of astragalus extracts in a dose dependent manner（F=56.356 and 77.125 respectively,and P＜0.05 in both cases）.ConclusionAstragalus extracts play important role in angiogenesis in EPCs probably through up-regulating expressions of eNOS.

Astragalus membranaceus；myeloid progenitor cells；cell adhesion；cell movement；endothelial progenitor cells；angiogenesis；endothelial nitric oxide synthase

R322.11；R322.12

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.002

国家自然科学基金资助项目（81473438，81202791，81173372）；河南省中医内科学重点学科支撑课题（豫教高［2012］186号）

南阳理工学院医学实验中心（邮编473004）

刘暖（1987），医学硕士，助教，主要从事心血管疾病发病机制研究

△通讯作者E-mail:yanglei200609@126.com