大黄素对重症急性胰腺炎肠黏膜屏障的保护作用及机制

陈霞，赵宏贤，王巧稚，李昌平

大黄素对重症急性胰腺炎肠黏膜屏障的保护作用及机制

陈霞1，赵宏贤2，王巧稚2，李昌平1

目的从细胞凋亡方面，探讨大黄素对重症急性胰腺炎（SAP）肠黏膜功能障碍的保护作用及相关作用机制。方法SD大鼠30只，按随机数字表法分为假手术组、SAP组和大黄素组。采用胰管逆行注射3%牛磺胆酸钠溶液制作SAP模型，大黄素组制作SAP模型1 h后给予大黄素25 mg/kg腹腔注射，2 h后重复1次。TUNEL法检测回肠黏膜细胞凋亡；免疫组化法检测回肠黏膜细胞GRP78蛋白表达。结果与假手术组相比，SAP组大鼠肠黏膜细胞凋亡及GRP78蛋白表达明显增加（P＜0.05）；与SAP组相比较，大黄素组大鼠肠黏膜细胞凋亡减少（P＜0.05），GRP78蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论大黄素可减少SAP时的肠黏膜细胞凋亡，保护肠黏膜屏障，但这种保护作用似乎并未涉及到内质网应激途径。

胰腺炎，急性坏死性；急性病；肠黏膜；大黄素；细胞凋亡；大鼠，Sprague-Dawley；重症急性胰腺炎；葡萄糖调节蛋白78

肠黏膜屏障在维护肠功能中起着重要作用。肠黏膜屏障功能障碍（IBFD）是严重消化系统疾病的常见表现之一，与重症急性胰腺炎（SAP）病情严重程度密切相关［1-2］。SAP时IBFD是多因素共同作用下的病理生理过程。近期研究发现，SAP时肠黏膜上皮细胞凋亡增加，而肠黏膜细胞凋亡的抑制可改善肠黏膜屏障损伤，并减轻SAP时的内毒素血症［3-4］。大黄在临床中常单独或联合用于SAP肠功能障碍的治疗，然而大黄对SAP肠功能障碍防治作用的相关机制尚不完全清楚。大黄素是大黄的主要有效成分之一。本课题拟建立SAP大鼠模型，从细胞凋亡着手，探讨大黄素对SAP时肠黏膜屏障功能的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料健康纯系清洁级雄性SD大鼠30只，体质量200～250 g，由泸州医学院动物科提供；牛磺胆酸钠购于美国Sigma公司；TUNEL试剂盒（瑞典Roche Diagnostics公司）；葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）抗体购于美国Bioword公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及SAP造模SD大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为3组，每组10只。（1）假手术组：麻醉后开腹，胰管逆行注射生理盐水1 mL/kg，缝合腹腔。（2）SAP组：胰管逆行注射3%牛磺胆酸钠溶液1 mL/kg。（3）大黄素组：胰管逆行注射3%牛磺胆酸钠溶液1 mL/kg，1 h后腹腔内注射大黄素25 mg/kg，2 h后重复注射1次。所有动物术后均给予皮下注射生理盐水5 mL以补充血容量。自由饮水、进食。

1.2.2 病理学观察造模24 h后取胰腺组织，将胰腺置于10%中性甲醛中固定，行常规病理HE染色检查。光镜下观察胰腺病理改变。

1.2.3 TUNEL法检测细胞凋亡取回肠组织，常规石蜡切片制作，TUNEL法检测肠黏膜细胞凋亡。操作步骤参照文献［5］。细胞核棕黄（褐）色为阳性结果。每组取10个标本，显微数码照相，image-proplus 5.0软件计算各组细胞凋亡率。

1.2.4 免疫组化法检测GRP78蛋白的表达取回肠组织4%多聚甲醛固定，常规脱水石蜡包埋，切片，免疫组化操作步骤参考说明书。每组取10个标本，每个标本3张切片，显微数码照相，image-proplus5.0软件计算阳性细胞百分率。

1.3 统计学方法采用SPSS 14.0进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAP大鼠模型制备结果肉眼可见SAP组和大黄素组大鼠胰腺形态轮廓不规则，局部弥漫性水肿，被膜下可见出血斑，部分大鼠腹腔内可见血性腹水。SAP组和大黄素组大鼠胰腺组织切片可见胰腺大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，充填于腺泡之间，间质内部分血管壁坏死、出血，腺泡数量减少、杂乱，证明SAP大鼠模型制备成功，见图1。

2.2 细胞凋亡检测各组回肠黏膜细胞都存在凋亡，见图2。3组间凋亡率比较差异有统计学意义（F=47.794，P＜0.05），与假手术组（8.10%±1.62%）相比，SAP组（23.14%±3.56%）大鼠肠黏膜细胞凋亡明显增加（P＜0.05）。大黄素组（12.35%±4.32%）较SAP组黏膜细胞凋亡减少（P＜0.05）。

Fig.2TUNEL assay of ileum section which was counterstained with hematoxylin（DAB，×400）图2 TUNEL法检测各组大鼠回肠黏膜细胞凋亡（DAB染色，×400）

2.3 GRP78蛋白表达GRP78蛋白的阳性表达主要定位于细胞浆内，细胞膜上也可见少量表达，见图3。3组间阳性细胞表达率比较差异有统计学意义（F=41.841，P＜0.05）。与假手术组（15.62%±2.25%）相比，SAP组（28.02%±3.24%）肠黏膜细胞GRP78蛋白的表达明显增加（P＜0.05）。大黄素组（25.43%± 3.45%）与SAP组GRP78蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

Fig.3Immunohistochemistry staining of GRP78 protein in ileal epithelium sction（DAB，×400）图3 各组大鼠回肠黏膜细胞GRP78蛋白的表达（DAB染色，×400）

3 讨论

肠道除消化吸收功能外，还对肠道细菌及其毒素具有重要的屏障作用。肠黏膜屏障由机械屏障、微生物屏障、免疫屏障以及化学屏障共同构成。作为机体内最大的细菌库和毒素库，肠黏膜屏障功能破坏后可导致全身炎症反应综合征和多器官功能不全。SAP时不可避免出现肠黏膜通透性增加，黏膜屏障功能受损。

SAP时肠黏膜屏障功能障碍的发生机制尚不完全清楚，可能与炎症介质与细胞因子、微循环障碍、肠动力障碍、免疫功能障碍等因素有关，而上述因素最终都要通过作用于肠黏膜细胞，从而导致肠黏膜屏障损伤的发生，肠黏膜细胞损伤与修复是SAP时肠黏膜屏障功能障碍发生与转归的核心环节。本研究中，SAP大鼠肠黏膜细胞凋亡较假手术组明显增多，与既往的研究一致［3，5］。肠黏膜上皮细胞增生和凋亡之间的平衡可影响肠黏膜屏障功能。SAP时肠上皮细胞凋亡过度，修复与再生受阻，可造成肠黏膜屏障功能障碍。本研究同时发现，给予大黄素干预后SAP大鼠肠黏膜细胞凋亡明显减少。大黄是临床中用于SAP肠道衰竭的常用药物，并有较好的肠道保护作用。本研究结果提示大黄素可通过减少肠黏膜细胞凋亡来起到保护SAP时的肠道损伤。

内质网应激（ER stress，ERS）是近年来发现的十分重要的介导细胞凋亡的途径之一［6］。内质网是真核细胞中调节蛋白质合成、折叠与分泌的重要细胞器，调控细胞对应激的反应等。细胞受到环境毒物、缺氧、病毒、紫外线等刺激时内质网出现的腔内错误折叠、未折叠蛋白聚集以及Ca2+平衡紊乱等，可引起内质网功能紊乱，称为ERS。ERS可促进内质网发生一系列生理变化，处理蓄积在内质网腔内的错误折叠或未折叠蛋白，从而维持细胞的正常功能。但是过度的ERS可引起细胞凋亡，ERS信号由促生存向促凋亡转换。GRP78属于热休克蛋白（HSP70）家族，是ERS的主要调节器。GRP78通过与内质网膜3种跨膜蛋白解离与结合来启动或关闭ERS，因此GRP78作为内质网功能的中心调节者决定着细胞“生存”或“死亡”的命运［7］。GRP78的过表达常提示ERS的发生，并且对ERS信号传导起着关键作用。本研究结果显示，与假手术组相比，SAP组大鼠肠黏膜细胞GRP78蛋白表达增加，提示SAP大鼠肠黏膜细胞存在ERS。但是与笔者预期不同的是，给予了大黄素治疗的SAP大鼠肠黏膜细胞GRP78蛋白表达与SAP组相比差异并无统计学意义，显示大黄素对ERS并无调节作用。因此推测大黄素减少SAP大鼠肠黏膜细胞凋亡的作用似乎并不依赖ERS途径。

综上所述，肠黏膜细胞凋亡增加参与了SAP肠黏膜屏障功能障碍。大黄素可减少SAP时的肠黏膜细胞凋亡，保护肠黏膜屏障。大黄素的这种肠道保护作用似乎与ERS途径无关，尚需进一步探索其他保护机制，为大黄在临床治疗SAP肠功能障碍提供更坚实的理论和实验依据。

［1］Capurso G，Zerboni G，Signoretti M，et al.Role of the gut barrier in acute pancreatitis［J］.J Clin Gastroenterol，2012，46 Suppl:S46-51.doi:10.1097/MCG.0b013e3182652096.

［2］Tian R，Tan JT，Wang RL，et al.The role of intestinal mucosa oxidative stress in gut barrier dysfunction of severe acute pancreatitis［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（3）:349-355.

［3］Chen X，Zhao HX，Fu XS，et al.Glucagonlike peptide 2 protects intestinal barrier in severe acute pancreatitis through regulating intestinal epithelial cell proliferation and apoptosis［J］.Pancreas，2012，41:1080-1085.doi:10.1097/MPA.0b013e31824966b0.

［4］Han T，Li XL，Cai DL，et al.Effects of glutamine-supplemented enteral or parenteral nutrition on apoptosis of intestinal mucosal cells in rats with severe acute pancreatitis［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（11）:1529-1535.

［5］Zhao HX，Yang XH，Li CP，et al.Small intestinal smooth muscle cell apoptosis in rats with severe acute pancreatitis［J］.World Chinese Journal of Digestology，2014，22（28）:4231-4236.［赵宏贤，杨晓红，李昌平，等.重症急性胰腺炎对大鼠小肠平滑肌细胞凋亡的影响［J］.世界华人消化杂志，2014，22（28）:4231-4236］.doi: 10.11569/wcjd.v22.i28.4231.

［6］Fu XL，Gao DS.Endoplasmic reticulum proteins quality control and the unfolded protein response:the regulative mechanism of organisms against stress injuries［J］.Biofactors，2014，40（6）:569-585.doi: 10.1002/biof.1194.

［7］Zhu G，Lee AS.Role of the unfolded protein response，GRP78 and GRP94 in organ homeostasis［J］.J Cell Physiol，2014，230（7）:1413-1420.doi:10.1002/jcp.24923.

（2015-04-08收稿 2015-08-06修回）

（本文编辑 魏杰）

Protective roles of Emodin in the intestinal mucosal layer of rats with severe acute pancreatitis

CHEN Xia1，ZHAO Hongxian2，WANG Qiaozhi2，LI Changping1
1 Department of Gastroenterology of Affiliated hospital，Luzhou 646000，China；2 Department of Histology and Embryology，Sichuan Medical University

ObjectiveTo explore the protective roles of Emodin in the intestinal mucosal lay of rats with severe acute pancreatitis（SAP）and its mechanism.MethodsSD rats（n=30）were divided into 3 groups:sham operation group，SAP group and Emodin group（SAP rats treated with Emodin）.The SAP rat models were established via retrograde injection of 3% sodium taurocholate to pancreatic duct.Rats in Emodin group were peritoneally injected with Emodin（2.5 mg/100 g）at both 1 hour and 3 hour after sodium taurocholate injection.Apoptosis of intestinal epithelial cell was detected by TUNEL analysis.The expression of glucose-regulated protein78（GRP78）protein was assessed by immunohistochemistry.ResultsCompared with sham operation group，apoptosis in intestinal epithelial cells and the expression of GRP78 protein were increased significantly in SAP group（P＜0.05）.Emodin treatment reduced AP-induced mucosal intestinal epithelial cell apoptosis（P＜0.05）.But there is no significant difference of GRP78 expression between SAP group and Emodin group（P＞0.05）. ConclusionEmodin has a protective effect on intestinal layer in rats with SAP through inhibiting intestinal epithelial cell apoptosis.However，ER stress is not likely to be involved in this protective effect.

pancreatitis，acute necrotizing；acute disease；intestinal mucosa；Emodin；apoptosis；rats，Sprague-Dawley；severe acute pancreatitis；glucose-regulated protein78

R576.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.014

四川省卫生厅科研项目（130369）

1泸州医学院附属医院消化内科（邮编646000）；2四川医科大学组织胚胎学教研室

陈霞（1978），女，副主任医师，硕士，主要从事肠黏膜屏障方面研究