CEUS定量分析L-NAME致兔高血压性肾损伤的实验研究

2015-11-24孟祥鹿张国慧王文红邵红郭君赵效新顾程张晓丹

天津医药 2015年12期

孟祥鹿，张国慧，王文红，邵红，郭君，赵效新，顾程，张晓丹

孟祥鹿1，2，张国慧3，王文红2△，邵红2，郭君3，赵效新1，2，顾程1，2，张晓丹4

目的应用超声造影（CEUS）定量评价一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）致兔高血压肾损伤后肾皮质的血流灌注变化。方法建立L-NAME致兔高血压肾损伤模型，分别于给药前及给药后第2、4、6、8周行CEUS检查及血清胱抑素C（CysC）等生化检查，将所获得的时间-强度曲线（TIC）曲线下面积（AUC）等相关参数进行定量分析，并将AUC与血清CysC进行相关性分析。结果兔血清CysC在给药6周后明显升高，明显早于血肌酐（Scr）及血尿素氮（BUN）。给药后AUC先减小后增大，开始增强时间（RT）延长，峰值强度（PI）减低，平均通过时间（MTT）、峰值减半时间（HPT）及达峰时间（TTP）延长。CEUS所得AUC与血清CysC呈显著正相关（r= 0.950，P＜0.001）。结论L-NAME致兔高血压肾损伤模型操作简单、可重复性好，可用于对高血压肾损伤临床前期及临床期的药物实验研究。CEUS结合血清CysC可作为临床评价高血压肾损伤患者肾功能异常的良好检查方法。

高血压；NG-硝基精氨酸甲酯；兔；高血压肾损伤；超声造影；血清胱抑素C；肾血流灌注

长期高血压将致肾小球长期处于高灌注、高滤过状态，肾小球滤过膜受损，系膜细胞增殖硬化，局部肾小球及肾小管缺血，直至肾功能损伤，最终导致终末期肾病。因此，及时了解高血压肾损伤患者不同阶段的肾血流灌注异常对临床医师根据病程进展及早制定治疗方案、准确评估预后有重要意义［1］。本

研究应用超声造影（contrast-enhanced sonography，CEUS）定量分析大剂量一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginin methylester，L-NAME）致兔高血压肾损伤不同阶段的肾血流灌注异常，以期为临床前期研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料天津医科大学实验动物中心提供的新西兰大白兔11只，质量1.5～2.0 kg，周龄相同，均为雌性（符合国家动物保护协会相关规定）。将L-NAME（美国Sigma公司）溶于15 mL 0.9%NaCl中，按每天每只兔150 mg/kg灌胃，持续8周。灌胃前、灌胃后第2、4、6、8周抽血检测血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、血清胱抑素C（CysC），并在24 h内行CEUS检查。并于上述5个时间点，各处死1只兔子，取双侧肾脏送病理检查。模型建立成功表现为给药8周后兔血清CysC及收缩压明显升高。

1.2 检查方法采用Philips iU22彩色超声诊断仪、L12-5高频超声探头。实验前去除兔肾区体毛，用灰阶二维超声观察兔肾位置并作标记，用盐酸氯胺酮（50 mg/kg）及咪达唑仑注射液（1.0 mg/kg）肌内注射麻醉并将其固定，经耳缘静脉团注超声造影剂SonoVue混悬液（0.1 mg/kg），同时启动内置计时器，观察3 min内一侧肾皮质回声变化，并进行自动序列采集。至少间隔约20 min后，再次注入SonoVue混悬液（0.1 mg/kg），观察另一侧肾脏（谐波发射频率15 Hz，机械指数0.07，增益90%，聚焦深度3～4 cm）。用Q-LAB软件进行定量分析，将感兴趣区域（region of interest，ROI）置于肾脏中部外侧皮质，避开粗大血管，观察其内各像素及造影剂微泡回声量的变化。获得时间-强度曲线（time-intensity curve，TIC）及肾脏血流灌注的相关参数，包括曲线下面积（area under curve，AUC）、达峰时间（time to peak，TTP）、峰值强度（peak intensity，PI）、平均通过时间（mean transit time，MTT）、开始增强时间（rise time，RT）、峰值减半时间（time from peak to one half，HPT）。由2名有经验的超声诊断医师采用双盲法进行定量分析，取2次检查结果的平均值。

1.3 统计学方法数据分析用SPSS 17.0软件包完成，计量资料用均数±标准差表示。给药后各时间点与给药前兔肾皮质TIC相关参数间比较采用配对资料t检验。兔肾皮质AUC与血清CysC的相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 给药前、后各时间点兔肾皮质TIC相关参数的比较与给药前相比，RT在给药后第2周、第8周延长（P＜0.01）；AUC在给药后第2周、第4周降低，6周后明显增高，且第6周、第8周与给药前相比差异均有统计学意义（P＜0.01）；PI在给药后第6周、第8周下降（P＜0.01）；MTT在给药后第4周开始延长（P＜0.05或P＜0.01）；HPT于给药后第2周延长（P＜0.01）；TTP于给药后第2周逐渐延长，除第4周外，其余各时间点与给药前相比差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1、表1。

Fig.1TIC and HE staining of left renal cortex of rabbits before and after injecting L-NAME图1 给药前、后兔左肾皮质TIC和HE染色

Tab.1TIC parameters in renal cortex of rabbits before and after injecting L-NAME表1 给药前、后兔肾皮质TIC曲线各时间点相关参数比较

t2、t4、t6、t8：分别为给药后第2、4、6、8周与给药前比较；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表2同

组别给药前给药后t 2 t 4 t 6 t 8 T T P（s）7 . 7 2 3 ± 1 . 9 1 8 8 . 7 2 0 ± 1 . 4 0 8 8 . 5 1 5 ± 2 . 9 7 9 1 1 . 0 3 2 ± 2 . 5 7 6 1 1 . 2 3 7 ± 2 . 5 0 2 2 . 3 5 7＊2 . 1 7 5 7 . 0 4 9＊＊7 . 9 3 1＊＊第2周第4周第6周第8周n（肾数）1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 R T（s）1 . 2 3 7 ± 0 . 5 0 8 2 . 2 7 3 ± 0 . 3 2 4 1 . 7 2 0 ± 0 . 3 0 5 1 . 8 8 3 ± 0 . 4 8 4 3 . 4 4 2 ± 0 . 8 6 4 6 . 7 3 0＊＊1 . 8 4 5 1 . 9 1 5 8 . 8 6 4＊＊A U C（d B · s）3 6 9 . 0 8 7 ± 1 2 9 . 5 1 3 5 4 . 7 6 3 ± 8 6 . 2 0 2 3 3 4 . 8 3 0 ± 9 0 . 5 3 7 3 9 7 . 8 5 7 ± 4 3 . 2 0 0 4 7 2 . 6 6 7 ± 5 4 . 4 5 7 0 . 6 4 8 1 . 7 5 8 3 . 1 6 1＊＊5 . 3 0 1＊＊P I（d B）1 0 . 3 5 1 ± 3 . 7 9 7 9 . 9 3 8 ± 2 . 9 6 1 8 . 5 9 1 ± 2 . 7 5 8 7 . 5 8 8 ± 2 . 7 8 2 6 . 8 5 0 ± 2 . 7 0 9 0 . 5 2 2 2 . 1 3 1 4 . 3 9 4＊＊5 . 1 2 0＊＊M T T（s）1 5 . 1 0 3 ± 4 . 7 1 6 1 8 . 7 7 5 ± 3 . 8 9 4 1 9 . 7 9 2 ± 5 . 9 5 8 2 3 . 8 8 5 ± 5 . 4 9 2 2 8 . 6 3 2 ± 9 . 4 8 8 1 . 6 4 9 2 . 3 9 2＊4 . 6 7 1＊＊5 . 3 3 6＊＊H P T（s）1 4 . 9 7 7 ± 3 . 7 2 2 2 9 . 4 4 3 ± 6 . 6 3 8 2 2 . 8 4 8 ± 5 . 2 3 1 2 1 . 3 4 0 ± 4 . 9 2 5 2 0 . 8 2 3 ± 2 . 8 0 2 5 . 5 6 7＊＊3 . 4 2 5＊＊2 . 6 7 6＊2 . 5 0 6＊

2.2 给药前、后各时间点兔血Scr、BUN及CysC的比较与给药前相比，给药后各时间点，兔血BUN均无明显改变，差异无统计学意义；兔血Scr于给药后第8周升高（P＜0.05）；兔血清CysC自给药后第6周即明显升高（P＜0.05），见表2。

Tab.2Comparison of BUN，Scr and CysC of rabbits before and after injecting L-NAME表2 给药前、后各时间点兔血BUN、Scr及CysC比较

B U N（m m o l / L）8 . 2 2 5 ± 1 . 7 7 9 7 . 3 6 2 ± 3 . 6 0 8 8 . 2 4 3 ± 0 . 9 3 4 8 . 7 4 2 ± 0 . 8 7 6 9 . 5 4 7 ± 0 . 5 9 0 0 . 7 2 3 0 . 0 2 6 0 . 4 1 7 1 . 7 8 8组别给药前n（兔只数）给药后t 2 t 4 t 6 t 8第2周第4周第6周第8周6 6 6 6 6 S c r（μ m o l / L）5 0 . 6 6 7 ± 4 . 6 3 2 4 9 . 3 3 3 ± 6 . 6 2 3 5 4 . 8 3 3 ± 4 . 6 2 2 6 3 . 1 6 7 ± 9 . 5 1 7 6 9 . 1 6 7 ± 7 . 6 7 9 0 . 2 1 6 2 . 0 8 8 2 . 1 5 7 3 . 0 8 3＊C y s C（μ g / L）1 . 2 0 4 ± 0 . 1 1 8 1 . 2 1 8 ± 0 . 1 1 8 1 . 2 3 1 ± 0 . 1 7 7 1 . 3 0 9 ± 0 . 1 3 3 1 . 4 6 1 ± 0 . 0 8 6 0 . 3 4 3 1 . 5 0 4 2 . 6 2 9＊5 . 0 4 8＊＊

2.3 给药前、后各时间点兔肾皮质AUC与血清CysC相关性分析给药前、后各时间点兔左肾皮质AUC平均为（383.241±53.280）dB·s，血清CysC平均为（1.285±0.107）μg/L，肾皮质AUC与血清CysC呈正相关（r=0.950，P＜0.001）。

3 讨论

肾脏是高血压最常损伤的靶器官之一，长期高血压会导致肾脏小动脉损伤，这种肾微血管的损伤会造成肾血流灌注下降，且随肾脏受损程度加重，肾血流减少更加明显，而持续性肾缺血性改变最终会导致肾衰竭。因此，早期发现、准确评估高血压肾损伤对临床及时采取防治措施、延缓病情进展有重要的临床意义［2］。国内外文献有利用L-NAME建立动物高血压肾损伤模型的报道［3-4］。L-NAME是肾功能介质一氧化氮合成酶的选择性抑制剂，可造成一氧化氮缺乏性血压升高，且具有剂量依赖性。本研究显示连续大剂量给予L-NAME，可成功建立兔高血压肾损伤模型，操作简单、状态稳定、具有可重复性，且能与不同程度肾损伤的病理改变相对照，有助于临床动态观察及评估肾脏损伤程度，对肾灌注异常病变临床前期及临床期的药物实验研究有重要意义。

CEUS是近年来迅速发展的一项评价微循环及组织灌注情况的新技术［5］。肾脏丰富的血供及特殊的微血管分布模式为CEUS提供了非常有利的条件。常规超声检查虽可清晰显示肾脏的解剖结构及形态变化，但无法评估肾功能异常。CEUS所用造影剂为血池造影剂，正常情况下不会进入组织细胞间隙，只随血液分布到全身各组织器官，能够清晰显示肾脏的血供情况［5］。CEUS通过接收造影剂微泡产生的谐波信号，实时动态观察肾血流灌注，特别是分侧肾的血流灌注异常，并能定量分析肾组织的血流动力学变化［6-7］。董怡等［7］对41例早期肾功能损伤患者行CEUS定量分析，结果显示CEUS能敏感地评价肾脏血流动力学的改变，提示肾功能的早期损伤，并可以分别衡量左、右侧肾的灌注情况。Ma等［8］对23例糖尿病肾损伤患者的研究发现，CEUS可实时、动态、准确评估患者肾微循环灌注，PI、TTP和AUC等参数对早期肾损伤的诊断有重要意义。本研究显示给药后第6周PI下降，MTT、HPT和TTP延长，AUC明显增加，说明CEUS检查对肾血流灌注的早期变化灵敏度较高，与文献报道一致［7-8］。

国内外研究报道血清CysC是反映肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）早期变化的特异性标志物［9］，其水平不受年龄、性别、饮食、药物、肝脏疾

病等因素干扰。当肾功能早期损伤时，GFR下降，血清CysC随之升高［10］。本研究显示CEUS检查所得AUC和血清CysC呈正相关，给药后第6周，AUC增加，血清CysC显著增高，较BUN和Scr敏感，可以反映肾脏早期损伤后肾功能的改变。血清CysC检测方法简便、费用低，缺点是其无法观察并评估肾形态学改变及分侧肾功能变化。单光子发射体层成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）肾动态显像是目前临床上评估双肾及分侧肾GFR的首选检查方法，不仅可以计算出双肾及分侧肾的GFR，还可以获得其灌注曲线和功能曲线，相对直观地观察双肾的形态、大小、血流灌注及排泄等情况［11］。但其图像分辨率较低，难以清晰显示肾脏皮、髓质等解剖细节，存在一定的放射性污染和肾毒性，费用相对较高，临床应用受到一定限制。

CEUS可用于定量评估高血压早期肾功能，特别是分侧肾功能的变化，操作简单、费用低廉、能清晰显示肾实质内的微小血管，不存在放射性污染和肾毒性，易于随访，特别是对于糖尿病肾损伤、高血压肾损伤等慢性肾脏疾病患者，具有重要的临床意义［12］。但是CEUS也有其自身的局限性。首先，CEUS选取的研究对象是一个切面，不能完全代表整个肾脏的血流情况，且会随患者的呼吸运动发生细微变化，可能会使分析结果存在一定误差；其次，心动周期对患者肾脏血流灌注的影响亦会对所测参数造成一定影响［8］。

综上所述，CEUS结合血清CysC可作为评价高血压肾损伤患者肾脏血流灌注及滤过的重要指标，是一种检测高血压早期肾损伤的可靠方法。

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（2015-06-02收稿 2015-08-20修回）

（本文编辑李国琪）

Quantitative analysis of renal injury using CEUS in hypertensive rabbits model induced by L-NAME

MENG Xianglu1，2，ZHANG Guohui3，WANG Wenhong2△，SHAO Hong2，GUO Jun3，ZHAO Xiaoxin1，2，GU Cheng1，2，
ZHANG Xiaodan41 Tianjin Medical University Graduate School，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Union Medicine Centre；3 Ultrasound Department，Aero Space Center Hospital；4 Ultrasound Department，Affiliated Hospital of Hebei Medical University△

ObjectiveTo assess the value of contrast-enhanced ultrasound（CEUS）on quantitative analysis of renal cortex perfusion in hypertensive rabbits model.MethodsHypertensive rabbit modal（n=10）were established by injecting N-nitro-L-arginin methylester（L-NAME）.CEUS and Cystatin C（CysC）serum level analysis were performed at different time points:before and the 2nd，4th，6thand 8thweek after injecting L-NAME.Time-intensity curve and area under curve（AUC）were analyzed quantatively while correlation of AUC and CysC were also analyzed.ResultsSerum level of Cys C increased significantly at the 6thweek after L-NAME administration which is earlier than the increase of serum levels of Scr and BUN.AUC decreased at first then increased after L-NAME administration.Upon addition of L-NAME，rise time（RT）and peak intensity（PI）decreased while mean transit time（MTT），time from peak to one half（HPT）and time to peak（TTP）increased.Our study confirmed a positive correlation between AUC and Cys C（r=0.950，P＜0.001）.ConclusionSetting up rabbits model by L-NAME is convenient and reproducible，which is an useful tool in experimental study of preclinical and clinical phase of hypertensive renal injury.CEUS combining with CysC serum level analysis is considered as an effective technology for evaluating renal function in hypertensive patients.

hypertension；NG-nitroarginine methylester；rabbits；hypertensive renal injury；contrast-enhanced sonography；cystatinC；renal perfusion

R445.1

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.013

天津市卫生局基金资助项目（2011KZ52）

1天津医科大学研究生院（邮编300070）；2天津市人民医院；3北京，航天中心医院超声科；4河北大学附属医院超声科

孟祥鹿（1989），女，硕士在读，主要从事腹部疾病的研究

△通讯作者E-mail:wangwenhong2014@126.com