一株水貂源伪狂犬病毒株的分离鉴定

李富金 王蕾 李金波 秦绪伟



一株水貂源伪狂犬病毒株的分离鉴定

李富金 王蕾 李金波 秦绪伟

（齐鲁动物保健品有限公司 山东济南 250100）

从辽宁大连疑似水貂伪狂犬病发病死亡水貂脑、内脏中及饲喂的猪肝中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种BHK-21细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE)；分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；分离病毒接种家兔后，引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状；同时根据GenBank公布的PRV的基因设计引物并扩增出特异性的目的片段，扩增产物经过测序比较，表明扩增产物序列为猪伪狂犬病毒gE基因序列。以上结果表明，该病毒为伪狂犬病毒，依据来源确定为水貂源性伪狂犬病病毒株。

伪狂犬病是由疱疹病毒科伪狂犬病毒引起猪、马、牛、羊等家养动物，犬、猫等伴侣动物，家兔和小鼠等实验动物，以及水貂、狐狸等毛皮动物等多种动物的一种传染病[1]。在兽医临床上猪的伪狂犬病最为常见，随着我国养猪业集约化、规模化的发展，20多个省、市(区)相继报道了本病的发生，并且引起新生仔猪的急性死亡及4周龄以上的仔猪表现神经症状[2]。近几年狐、貉、貂等毛皮动物养殖者为了减低成本，用猪、牛、羊、兔的下脚料作为蛋白日粮，如果日粮污染了伪狂犬病毒，就会引起毛皮动物感染，貂、狐、貉感染后出现奇痒和脑脊髓炎，动物出现自咬、呼吸困难等临床表现。笔者最近接诊辽宁大连一例病例，近1000水貂及2000只狐貉死亡，笔者从疑似伪狂犬病的病死水貂脑、内脏及饲喂的猪肝内分离到同一株病毒，并进行了初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）病料：无菌采集疑似伪狂犬病死水貂脑、肺、淋巴结及日粮原料猪肝为分离病毒病料。（2）细胞：仓鼠肾细胞(BHK-21)由齐鲁动物保健品有限公司研究所保存。（3）DMEM：培养基细胞生长液：10%血清的DMEM营养液，细胞维持液：2%血清的DMEM营养液，购自GIBICO。（4）标准阳性血清、阴性血清及PRV标准强毒株，由齐鲁动物保健品有限公司研究所保存。（5）实验动物：家兔、小白鼠，由齐鲁动物保健品有限公司质检部提供。（6）聚合酶链反应(PCR)仪。

1.2 方法 （1）按照伪狂犬病毒分离方法进行[3]。（2）病料处理：无菌取病水貂脑组织、淋巴结、肺等组织，用灭菌生理盐水配成1:5乳悬液，匀浆，反复冻融3次，以3000r/min离心10min，取上清液加入青霉素和链霉素溶液，置4℃冰箱中作用12h备用；作为日粮组分的猪肝用灭菌生理盐水配成1:5乳悬液，匀浆，反复冻融2~3次后，以3000r/min离心10min，取上清液加入青霉素和链霉素溶液，置4℃冰箱中作用12h备用。（3）家兔接种试验：取2只健康成年家兔，颈部皮下注射2ml，另设注射无菌生理盐水的2只为对照。（4）小鼠接种试验：取8只小白鼠皮下注射病料滤液0.2ml/只，另设注射无菌生理盐水的2只为对照。（5）病毒培养与传代：在长成单层的BHK-21细胞上接种0.5ml病毒滤液，在37℃浓度为5%的CO2中培养4~6d。每天观察细胞病变(CPE)，当出现70%CPE收获病毒，经3次反复冻融，以5000r/min离心，用上清液接种细胞。（6）毒价测定：取病毒培养物，经10倍系列稀释，按0.1ml接种96孔细胞培养板，每个稀释度设8个孔，每天观察CPE产生情况，按Reed-Muench法计算TCID50。（7）中和试验：将PRV阳性血清和阴性血清分别进行10倍系列稀释，加等量的200TCID50，37℃作用20min。分别接种96孔板单层 BHK-21细胞，每孔0.1ml，每个稀释度接种8孔，第11列为空白对照，第12列为标准强毒株对照(200TCID50)。记录各个梯度的细胞病变数，连续观察5d。同时设标准强毒株与阳性血清及标准强毒株与阴性血清对照。方法同上。（8）引物设计：根据GenBank已公布的PRVgE基因序列设计一对引物，对病毒进行鉴定。上游引物：5'-GCCCACGCACGAGGACT ACTACGA-3'下游引物：5'-TTAAGCGGGGCGGGACAT CAACAG-3'，扩增长度298bp。（9）聚合酶链式反应(PCR)：将病毒接种BHK-21细胞，当细胞病变达70%以上时收集细胞，酚-仿法提取病毒DNA，PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃ 30s，65℃30s，72℃ 30s，30个循环。72℃延伸8min，最后取PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳鉴定。

2 结果

2.1 家兔接种试验 水貂内脏及猪肝病料处理滤液在接种家兔后24~36h体温升高，因接种部位奇痒而用嘴啃咬，致使接种部位脱毛，皮肤溃烂出血。家兔躁动不安，不时转圈，呼吸急促，至48h四肢麻痹，抽搐而死。对照组家兔健康无发病。

2.2 小白鼠接种试验小鼠接种水貂内脏及猪肝病料处理滤液24h内都出现了兴奋不安，食欲下降，36h后出现被毛杂乱，用嘴咬接种部位，48h后小鼠全部死亡。对照组小鼠健康无任何症状。

2.3 接种细胞的病变 水貂病料接种BHK细胞后，P1代培养96h无CPE，P2代培养72h出现细胞脱落现象，P3代培养24h出现细胞融合、脱落现象。猪肝病料接种BHK细胞后，P1、P2代培养96h无CPE，P3代培养24h出现细胞融合、脱落现象，见图1。

图1 病料引起BHK细胞CPE(左图)和正常BHK细胞(右图)

2.4 病毒 TCID50测定 按Reed-Muench法测得病毒滴度为104TCID50/ml。

2.5 中和试验结果 PRV阳性血清能够抑制细胞病变的产生，表明阳性血清对分离株病毒有中和能力，分离的病毒是伪狂犬病毒。

2.6 PCR扩增及测序结果 水貂病料培养物及猪肝病料培养物均扩增出了特异性片段，长度为298bp，与预期目的片断相同(见图2)，二者测序结果相似性99.7%，序列Blast与GenBank收录的PRV gE基因(AY170318)相似性98%。

图2 病料接种BHK-21细胞培养物PCR产物电泳图

左图：M：Marker DL2000；1：阴性对照；2：水貂病料细胞培养物P3代。右图：M：Marker DL2000；1：猪肝病料细胞培养物P3代；2：阴性对照。

4 讨论

（1）本次辽宁大连水貂发病死亡是饲喂了猪肝后急性发病，本试验从疑似伪狂犬水貂病料中分离到一株伪狂犬病毒，从饲喂的日粮猪肝中也分离到同一病毒，因此判断，水貂伪狂犬病毒的来源是猪肝。从而为毛皮动物伪狂犬病实施科学有效防治措施提供依据。（2）一些养殖户为了降低成本，有时候选用病死猪、牛、羊、家禽作为毛皮兽肉食饲料，而这些饲料安全性比较差，可能含有大量病毒、病菌及毒素等，一旦处理不好就会引起食物中毒。病从口入，预防该病还要从食物上着手，对来源不明的猪、牛、羊、兔等下脚料一定熟喂，并认真检查是否熟透，还要做到生熟分开，浸泡畜禽副产品的水经消毒后排放。加强灭鼠工作，防止带毒老鼠污染食物。（3）近几年河北昌黎、乐亭、石家庄，山东临沂、潍坊等毛皮动物养殖集中区域都有毛皮兽伪狂犬病发生，损失惨重。临床调查显示，发病案例都有饲喂猪、牛下脚料的饲喂史或者挨着猪场比较近，毛皮动物伪狂犬防疫刻不容缓。

[1] 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所. 动物传染病学(第1版)[M]. 北京: 中国农业出版社. 1999. 177-179.

[2] 陈焕春, 方六荣, 何启盖等. 猪伪狂犬病A株的分离鉴定[J]. 畜牧兽医学报. 1998. 29(2): 156-161.

[3] 殷震, 刘景华主编. 动物病毒学(第2版)[M]. 北京: 科学出版社. 1997. 988-1009.

[4] 王殿永,秦绪伟,许凌涵等.一起狐、貉伪狂犬病的诊治[J]. 山东畜牧兽医. 2013(1).

[5] 赵支国. 食源性伪狂犬病引起多种动物死亡的病例分析[J]. 北方牧业. 2013(4): 27.

（2015–04–08）

S852.65+5

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1007-1733(2015)07-0010-02