热应激对雌鼠卵巢内酶代谢的影响

于枫 徐海滨 张达 侯振中 田文儒



热应激对雌鼠卵巢内酶代谢的影响

于枫①③徐海滨③张达④侯振中①田文儒*②

（①东北农业大学动物医学学院 哈尔滨 150030 ②莱阳农学院 山东莱阳 ③山东畜牧兽医职业学院 潍坊 ④黑龙江大学 哈尔滨）

研究热应激条件下，卵巢中谷胱甘肽(GSH)、ATP酶、乳酸脱氢酶(LDH)含量的变化，从而评定热应激对雌性动物卵巢的损伤程度。试验将雌鼠分为6个处理组：37℃ 1h、37℃ 2h、39℃ 1h、39℃ 2h、41℃ 1h、41℃ 2h，连续7d进行热应激，测定小鼠卵巢GSH、ATP、LDH的含量。结果表明：热应激后，小鼠卵巢中GSH、ATP酶含量在37℃ 2h时开始下降，随着温度的升高和时间的延长这两种酶的含量呈减少的趋势。LDH含量在39℃开始升高，且随着应激强度增强而增多。从而说明卵巢开始出现损伤是从37℃(2h)开始，随着热应激温度升高和时间的延长，卵巢的受损伤程度升高。

小鼠 热应激 GSH ATP LDH

随着全球气候温室效应的不断加剧，全球变暖，作为最重要环境应激因素的热应激越来越引起人们的关注，主要原因是热应激对各种动物尤其是经济动物有很大的影响，损害了养殖户的利益，严重制约了养殖业的发展。

酶是动物进行新陈代谢的催化剂，对动物体内的多种化学反应起重要作用。但是在热应激状态下，动物的代谢系统受到干扰，造成了血清中酶的活性和含量发生变化。国内外许多学者报道了高温热应激对动物机体内各种酶的影响。

目前，国内对热应激时酶变化的研究侧重于血液中各种酶，对自由基研究着重于肝损伤和心脏缺血再灌注时自由基的清除，对能量代谢研究着眼于心肌和肝在热应激时的能量变化，而对在繁殖中占有重要地位的卵巢在应激时上述变化的研究却很少见报道。而卵巢机体受到应激时的变化却是至关重要的，如果卵巢机能减退，将会影响排卵。因此本试验将热应激应用到活体雌鼠上，揭示热应激主要生殖器官的卵巢的能量代谢及清除自由基的变化，评定热应激对雌性动物卵巢的损伤程度。为其他应激对生殖器官损伤的研究提供模型。

1 材料和方法

1.1 试验动物及热休克处理 昆明系健康小鼠(已达性成熟，体重在25±0.5g)由实验室自繁自养，随机分为对照组和实验组。对照组常规条件下饲养(25℃)。通过热应激后小鼠的行为表现、肛温、半数致死量(热应激引起)确立热应激的强度为37℃1h、37℃2h、39℃1h、39℃2h、41℃1h、41℃2h。将实验组放置于生化培养箱内(通气良好，湿度与外界保持一致)，自由采食和饮水，按照确立的热应激温度和时间进行处理，每隔10min观察箱内小鼠活动情况。连续处理7d。

1.2 小鼠卵巢的处理 将上述处理的小白鼠于第8日剖杀，收集的卵巢放入生理盐水中清洗干净，超声破碎，分装，-70℃冻存，待检。

1.3 GSH、LDH、ATP酶的测定 检测试剂盒购自南京建成，具体检测方法按三种测定试剂盒要求进行。

2 结果

2.1 小白鼠热应激后GSH含量变化 按照实验设计的处理方法，小鼠热应激后卵巢中GSH的测量结果见表1。

表1 热应激小鼠卵巢GSH变化 (mg/ml)

将表中数据进行统计分析，可以得出，卵巢中GSH 的变化情况是：37℃(1h)热应激处理组与对照组相比差异不显著(P>0.05)，37℃(2h)热应激处理组与对照组间差异显著(P<0.05)，39℃热应激处理组与对照组间差异显著(P<0.05)，41℃热应激处理组与对照组相比差异极显著(P<0.01)；在相同处理时间内，37℃处理组与39℃处理组相比差异显著(P<0.05)，39℃处理组与41℃处理组相比差异显著(P<0.05)，37℃处理组于41℃处理组间差异极显著(P<0.01)；在相同处理温度内，不同处理时间组间差异显著(P<0.05)。

2.2 小白鼠热应激后卵巢中Ca++Mg++-ATP酶、Na+K+-AT酶含量变化

表2 热应激小鼠卵巢中Ca++Mg++-ATP酶和Na+K+-ATP酶变化(μmol/mgprot/h)

（1）将表2中数据进行统计分析，可以得出，卵巢中Ca++Mg++-ATP酶的变化情况是：37℃ 1h热应激处理组与对照组间差异不显著(P>0.05)，37℃ 2h热应激处理组与对照组间差异显著(P>0.05)，39℃热应激组与对照组相比差异显著(P<0.05)，41℃处理组与对照组相比差异极显著(P< 0.01)；相同处理时间内，37℃处理组与39℃处理组间差异显著(P<0.05)，39℃处理组与41℃处理组间差异显著(P<0.05)，37℃处理组与41℃处理组间差异极显著(P<0.01)；相同处理温度，不同处理时间组间差异显著(P< 0.05)。（2）卵巢中Na+K+-ATP酶的变化情况是：37℃(1h)热应激处理组与对照组相比差异不显著(P>0.05)，37℃(2h)热应激处理组与对照组相比差异显著(P<0.05)，39℃、41℃处理组与对照组间差异极显著(P<0.01)；相同处理时间内，37℃处理组与39℃处理组间差异显著(P<0.05)，37℃处理组与41℃处理组间差异显著(P<0.05)，39℃处理组与41℃处理组间差异显著(P<0.05)；相同处理温度，不同处理时间组间差异显著(P<0.05)。

2.3 小白鼠热应激后卵巢中LDH含量变化

表3 热应激小鼠卵巢中LDH含量变化 (U/gprot)

37℃热应激处理组与对照组相比较差异不显著，39℃热应激处理组与对照组间差异显著(P<0.05)，41℃热应激处理组与对照组相比差异极显著(P<0.01)；在相同处理时间内，37℃处理组与39℃处理组相比差异显著(P< 0.05)，39℃处理组与41℃处理组相比差异显著(P<0.05)，37℃处理组于41℃处理组间差异极显著(P<0.01)；在相同处理温度内，不同处理时间组间差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 热应激对小鼠卵巢GSH含量的影响 GSH是机体内自由基防御系统中的一个重要物质(Ando M，1994)，因为它不仅能在酶的催化下和脂质过氧化物反应抑制自由基的形成，而且可和自由基直接反应使之转变为稳定分子，它通过自身巯基与自由基结合，从而清除生物体内氧化产生的自由基，维持细胞的正常的生长，保护细胞内含巯基酶的活性(如ATP酶)，防止由于巯基的氧化而导致蛋白质的变性，维持细胞内环境的稳定。从表1中可以看出，卵巢中，37℃(1h)处理组GSH的活性与正常对照组相比并没有发生明显变化，这是因为机体在正常情况下也会产生自由基，而37℃接近于动物体自身的温度，且应激时间不长，所以机体自由基的产生并未明显增多，因此，不需要过多动用GSH来清除自由基。从37℃(2h)开始，GSH含量开始明显减少，说明随着应激程度的增大，卵巢中产生了自由基，机体动用GSH来清除自由基。而在相同时间内，随着应激强度的加大，GSH的含量降低的幅度增大，说明随着应激强度的增大，机体产生的自由基增多，因此机体为了清除自由基来维持内环境的稳定，消耗GSH的量增加。在相同处理温度内，GSH的量与应激时间成负相关的趋势，随着应激时间的延长，GSH消耗量减少，这说明，应激时间的延长，机体产生的自由基也增多，所以GSH的消耗量也就相应增多。表1还可以说明，应激强度越大，应激时间越长，GSH的消耗就越多，这是因为还原型的GSH被氧化成氧化型的GSSG。机体正常情况下GSH和GSSG的比值处于一个稳态，GSH/GSSG的稳态是维持细胞正常生理过程的关键(Harris C.et al，1993)，同时它也是细胞内最重要的抗氧化系统之一。随着GSH含量的下降，GSSG含量的升高，GSH/GSSG的比值升高，说明机体处于较高应激状态。同时也说明随着时间的延长和温度的升高，卵巢的受损伤程度成升高趋势。

3.2 小白鼠热应激后卵巢Ca++Mg++-ATP酶、Na+K+-ATP酶含量变化 ATP酶是生物体内广泛存在的一种酶，主要存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它的功能主要是维持细胞内外的离子及渗透压平衡、跨膜电化学和细胞的能量代谢。Na+K+-ATP酶是镶嵌在质膜脂质双分子层中的一种蛋白质，具有载体和酶的活性。它催化ATP水解，提供能量驱动Na+和K+对向运输，使细胞内蓄积高浓度的K+，而细胞外则为高浓度的Na+状态，这是许多代谢反应进行的必备条件。钙镁三磷酸腺苷酶(Ca++Mg++-ATP酶)通过分解ATP供能，对调节细胞内钙稳态有重要作用。从表2可以看出，37℃热应激1h时，卵巢中Ca++Mg++-ATP酶的活性与正常对照组相比并没有发生明显变化，Na+K+-ATP酶的活性与对照组相比也未发生明显变化，这是因为，37℃接近动物的体温，属于较为温和的刺激，并且应激1h可能不足以使其发生变化，卵巢细胞并没有受到严重损伤，所以ATP酶的代谢并没有受到影响；而从37℃2h开始，Ca++Mg++-ATP酶的活性、Na+K+-ATP酶活性与对照组相比明显降低，这是因为高温改变了细胞膜的性状，细胞逐渐受到破坏，影响到酶的代谢，一些研究已经证实，细胞热应激损伤的首发部位是细胞质膜。推测机体高热可使细胞膜的流动性发生变化，从而导致细胞质膜稳定下降，影响膜上结合蛋白质的构象及其生物功能。同时，在热应激中产生大量的自由基，这点可从本实验中GSH含量的变化得出，自由基攻击细胞膜，自由基与酶蛋白发生共价键结合或酶含巯基的氨基酸氧化致酶结构变化，降低膜的流动性。Ca++Mg++-ATP酶、Na+K+-ATP酶都是膜结合蛋白，因此，细胞膜的损伤导致了Ca++Mg++-ATP、Na+K+-ATP酶活力的降低；而在39℃处理温度下，这两种酶与对照组相比变化程度不一致，是因为热应激时，Na+K+-ATP酶的活性与膜脂流动性特别是膜内流动性成正相关，这与姜振(2004)的报道相一致；而Ca++Mg++-ATP酶活性与脂质过氧化之间存在联系，其机理可能是脂质过氧化损伤细胞膜结构或抑制其呼吸功能而影响Ca++Mg++-ATP酶活性，这与汤平涛等（1998）的报道相一致。Na+K+-ATP酶活性比Ca++Mg++-ATP酶活力下降更为明显，可能是因为Na+、K+在细胞膜内外的浓度差要比Ca++、Mg++在细胞膜内外的浓度差大的缘故。在相同时间内，随着应激强度的增加，卵巢Ca++Mg++-ATP酶活性、Na+K+-ATP酶活力下降幅度增大，在相同处理温度内，随着时间的延长，卵巢Ca++Mg++-ATP酶活性、Na+K+-ATP酶活力下降幅度增大，主要是因为随着应激强度的加大，应激时间的延长，细胞膜受到的破坏程度增大，因此酶与细胞膜结合的程度下降，而导致酶活性下降幅度增大。从表2可以看出，随着热应激强度和应激时间的延长，卵巢中ATP酶的活性降低，ATP的分解减少，导致卵巢的供能减少，最后必将影响卵巢的正常生理功能。

3.3 小白鼠热应激后卵巢中LDH含量变化 LDH存在于人体各组织器官中。LDH是机体能量代谢中的一种重要酶，是糖代谢中催化丙酮酸向酵解方向的终产物乳酸转化的酶，动物体内LDH可使乳酸脱氢生成丙酮酸，也可使丙酮酸还原成乳酸。在厌氧酵解时，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下形成乳酸，它可缓解体内能量不足。从表3可以看出37℃处理组的卵巢的LDH含量与对照组相比并没明显的变(P>0.05)，这是因为在37℃时，机体内的氧并没有大量消耗，因此机体内糖代谢的途径依然是以有氧氧化为主；而从39℃开始处理组与对照组相比变化明显，并且在相同处理时间内，LDH含量随应激强度的加大而升高，主要是因为随着热应激强度的加大，引起机体呼吸和血液循环速率加快，以及氧和能量的大量消耗，因此细胞能量代谢方式和途径的改变也必然会影响其正常生命活动的进行。热应激时，糖代谢途径以产生大量能量的有氧氧化向无氧酵解方向转移，因此首先要保证中枢神经系统、心脏等重要器官的供氧，其他组织极可能在缺氧情况下采取无氧酵解方式供能。这样既保证机体能量需要又不过度增加机体散热。而在相同处理温度，不同处理时间组间LDH含量变化明显，这说明，随着应激时间时间的延长，机体的耗氧量增加，另外由于循环障碍也可造成组织供氧不足，因此，糖酵解加强。随着糖酵解作用的加强，一方面产生大量乳酸，可引起酸中毒等变化；另一方面可影响其他物质代谢和造成体内糖、脂肪、蛋白质的大量消耗，甚至引起机体消瘦、各组织器官激能活动和机体抵抗力降低。LDH变化也就在一定程度上反应处卵巢受损的情况。

结论：在37℃热应激处理2h后，小鼠卵巢中GSH含量、ATP酶含量时开始下降，且随着应激强度增强而下降。LDH含量在39℃开始升高，且随着应激强度增强而升高。卵巢出现受损是从37℃热应激2h开始。至于其它低于37℃的温度是否会导致卵巢出现损伤，由于试验的限制未曾证实，留待以后继续探讨。

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（2015–04–16）

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