简易悬吊术制备兔与大鼠深静脉血栓模型的研究

覃 锋张 力张春霞李杰辉刘秀娟

(1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530021)

简易悬吊术制备兔与大鼠深静脉血栓模型的研究

覃 锋1张 力1张春霞1李杰辉1刘秀娟2

(1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530021)

目的：采用简易悬吊术制备大鼠和家兔下肢深静脉血栓模型，同时将大鼠模型和家兔模型做一比较，探讨简易悬吊术是否为一种简便、适合动态研究深静脉血栓的造模方法，大鼠和家兔哪一种动物更适合该造模方法。方法：选用36只体重为（250±20)g的SD大鼠和42只体重为（2.5±0.5）kg的清洁级家兔，家兔按随机数字表法分为2组：动物模型组和假手术组。大鼠作为对照组。动物模型组及对照组均采用简易悬吊术制备动物模型。造模后观察不同时点动物模型血管内膜及血栓不同时期的病理变化。大鼠模型和家兔模型做比较并与假手术组做观察比较。结果：采用简易悬吊术制作模型后，大鼠模型和家兔模模型动物下腔静脉内不仅均形成稳定的血栓，而且形成血栓的动物存活率比较高，符合人体静脉血栓形成急性期的病理演变。家兔模型比大鼠模型造模操作更简单。结论：简易悬吊术可以成功制作适合动态研究药物对深静脉血栓形成(DVT)作用机制的家兔或大鼠深静脉血栓模型，家兔更适应于该方法造模。

简易悬吊术；大鼠；家兔；深静脉血栓模型

适合的下肢深静脉血栓形成(DVT)动物模型是动态研究药物对深静脉血栓形成(DVT)作用机制的关键。相关研究对动物模型要求较高，一要保证动物模型形成的血栓稳定可靠，且符合人体静脉血栓形成的病理学演变；二要保证动物模型成活率高，成活时间长。张惠明[1]在Reyers等[2]的大鼠下腔静脉结扎法制备DVT模型基础之上，以悬吊代替结扎，发明了一种新的下肢深静脉血栓形成(DVT)动物模型的造模方式。为进一步明确该造模方法是否简便，是否可重复，是否可以动态研究深静脉血栓形成，是否适用于用家兔造模，特进行以下实验：

1 材料及方法

1.1实验动物

清洁级家兔42只，体重2.5±0.5kg，雌雄不限，由广西医科大学动物实验中心提供。适应性喂养 1周后，采用随机数字表法分为2组：动物模型组36只，假手术组6只。

清洁级SD大鼠36只，体重250±20g，雌雄不限，由广西医科大学动物实验中心提供。适应性喂养 1周。作为对照组。

1.2实验方法

1.2.1造模

家兔动物模型组：以2%戊巴比妥钠溶液，以1ml/1kg耳缘静脉注射麻醉。先切开入腹，再打开后腹腔，游离肾静脉与下腔静脉汇合处及其下方 1.0cm长下腔静脉段。在肾静脉汇入下腔静脉下方穿过一条“1”号丝线（图1），引针将丝线两端穿过腹壁，引出腹腔。同样的方法在髂总静脉上方置一悬吊线。将肠管及其系膜回纳腹腔，调整悬吊线的位置以避免压迫肠管。将两条悬吊线打结分别固定在腹壁外，悬吊线的松紧度以其下可以穿过1支中华牌铅笔为度（图2）。生理盐水10.0ml注入腹腔中，关腹。在进行预实验时，发现有相当大一部分家兔腹部切口化脓感染，故在正式实验时，在缝合皮肤前，在肌肉层和皮肤层之间常规撒阿莫西林药粉0.025g，预防感染。

假手术组：6只家兔仅游离肾静脉与下腔静脉汇合处及其下方1.0 cm长下腔静脉段，并在相应部位穿过“1”号丝线后即关腹，其余同动物模型组。

大鼠对照组：操作方法与家兔组基本相同，不同之处如下：①麻醉采用2%戊巴比妥钠溶液1ml/100g腹腔注射麻醉；②关腹前，注入腹腔生理盐水2.0ml；③缝合皮肤前，不在皮肤层和肌肉层之间撒阿莫西林药粉。

1.2.2标本采取及制备

制模成功后，采用随机数字表法按术后6h和1、3、7、10、14d不同时点各取6只造模家兔及大鼠，分别抽取家兔及大鼠静脉血，量记抽血量。抽血后，前法麻醉后开腹，取出结扎线下方下腔静脉段血管，量记血栓长度，血管以生理盐水漂洗，10%甲醛固定。脱水后石蜡包埋、切片，行HE染色，在200倍光镜下观察并摄片。同法按术后6 h和1、3、7、10、14d不同时点各取1只假手术组家兔下腔静脉段血管并同样处理。

2 结果

2.1两模型组操作过程比较

造模过程中，最难之处就是游离下腔静脉，因为动静脉往往伴行，有时甚至是紧贴在一起。操作时，不仅要将静脉完整游离，不使动静脉破裂出血，而且要保证静脉不受到过多干扰，否则产生的血栓是由于悬吊形成的呢，还是由于造模过程中损伤了血管内膜，由此导致的血栓形成，导致疑问。在髂总静脉和肾静脉与下腔静脉汇合处之间，大鼠的动静脉连接异常紧密，要想完整分离，并做到不对静脉造成过多干扰，需要耗费较多时间和精力。而家兔对应段动静脉间间隙相对较松，可以相对轻松地在不对静脉造成过多干扰的情况下完成静脉游离。

2.2存活情况比较

家兔动物模型组在术后第3d和第4d分别死亡1只，存活率 94.44%；假手术组存活率 100%。大鼠动物模型无大鼠死亡，存活率100%。

存活率比较：大鼠模型组存活率100%，家兔模型组存活率97.22%，两者经卡方检验，X2=0.5143，P>0.05，无统计学差异。

2.3肉眼观察

家兔动物模型组：制模阻断下腔静脉6h后，可见两条原悬吊线间下腔静脉段血管壁弹性下降。剖开血管可见已形成的黑色血栓。术后6h家兔的后肢与腰臀部出现肿胀，随着时间推移，未见明显加重，于血栓形成后第4d逐渐缓解，活动增加、食欲改善。血栓形成后第14d，后肢与腰臀部仍有轻度肿胀。腹腔内均可见肠系膜静脉血管明显扩张。

大鼠动物模型组：血栓形成与演变与家兔动物模型组相似，只是大鼠动物模型组饮食、精神状态和活动较家兔动物模型组要佳，后肢与腰臀部肿胀消退相对稍快。

记录血栓形成的各组动物数量。其中家兔动物模型组和大鼠动物模型组血栓形成率均为100%。假手术组未见血栓形成。

量记血栓长度，血栓长度见表1。

表1　血栓长度(±S)

表1　血栓长度(±S)

注：两组比较，P<0.01，有显著差异。

组别 　例数 　血栓长度（mm）家兔动物模型组 　34 　16±5.43大鼠动物模型组 　36 　8±2.85

2.4镜下观察

无论是大鼠组还是家兔组，其血管切片在光镜下观察，所见大致相同：

假手术组：血管内膜表面平整，内皮细胞大小均匀、排列整齐，管腔内无血栓。血栓静脉周围小血管无扩张，未见明显炎细胞浸润（图3）。

动物模型组：①术后6h，静脉管腔可见血栓堵塞，血管内膜断裂、不规整，内膜下层裸露。②术后第1d，静脉管腔基本被血栓堵塞，血管内皮细胞损伤脱落，血栓静脉周围小血管扩张并见炎细胞浸润。血栓边缘可见珊瑚状血小板梁，中央纤维蛋白网束间有大量的红细胞和少量的白细胞，为混合血栓表现。血栓未见机化现象。③术后第3d，血栓静脉周围炎细胞增多，小血管扩张明显。血栓开始出现机化现象，可见个别纤维母细胞从血管壁进入血栓边缘，但未见新生毛细血管。④术后第7d，血栓机化表现明显，有肉芽组织生长，纤维母细胞数量增多但形态较幼稚。血栓中央可见大量的中性粒细胞浸润（图 4）。⑤术后第 10d，血栓机化明显，可见增生的肉芽组织长入血栓内部，纤维母细胞形态趋于成熟，新生毛细血管数量增多，血栓中中性粒细胞数量减少。⑥术后第14d，镜下可见机化组织向内部深入，替代了血栓部分，血栓内中性粒细胞已很少见，炎细胞以淋巴细胞、巨噬细胞为主。对照组均可形成稳定的血栓，其血栓演变规律与模型组类似。

2.5采血成功率及量

无论是大鼠组还是家兔组，均由有经验的护士耳部采血，成功率均为100%，但家兔静脉穿刺采血明显较大鼠静脉穿刺采血为易。

每只动物尽可能抽取血量，量记采血量，采血量见表2。

表2　采血量(±S)

表2　采血量(±S)

注：两组比较，P<0.01，有显著差异。

组别 　例数 　采血量（ml）家兔动物模型组 　34 　10±3.58大鼠动物模型组 　36 　6±2.65

3 讨论

DVT是一种严重危害人类健康的常见疾病，要更好防治，除临床研究外，实验研究也需加强，因此建立DVT动物模型就十分重要。如何以简易的方法建立一个稳定、价格低廉并符合血栓动态变化的实用DVT动物模型呢？

查阅资料，在研究药物在体内抑制血栓形成的作用及机制时，以Reyers等[2]建立的大鼠下腔静脉结扎法DVT模型应用最为广泛。其基本原理是以静脉结扎方式阻断下腔静脉，使局部血流淤滞、缺氧，血管内皮细胞损伤，瀑布式凝血系统启动，致使血栓形成。一般在静脉结扎6h后血栓形成率为100%。然而其建立的大鼠下腔静脉结扎法 DVT模型虽然可以形成稳定的混合血栓，但是仍有诸多缺点[3]，尤其是难于体现血栓动态变化。

张惠明、张力[1]对 Reyers的造模方法加以改良，发明了简易悬吊术，避免了因术后下腔静脉结扎处粘连而难以抽出的情况，以悬吊方法将下腔静脉实验段血管上、下阻断并放置6h，使所形成的血栓停滞在原悬吊线之间。此时，原悬吊处下腔静脉各属支血流缓慢，局部血流淤滞、缺氧，导致内皮细胞变性，细胞间连接破坏。血液中多核白细胞黏附受损的内皮，产生多种促凝因子，血小板聚集，加速血栓形成[4]。从而在术后各时点动物模型组中均可形成稳定的血栓。当静脉内形成的血栓较多较大、不能及时被完全吸收时，血栓部位的血管壁可生长出肉芽组织进入血栓内，将血栓逐渐机化、替代[5]。血栓形成后第3d左右开始机化，2～4周已完全机化并形成腔隙。

临床上，全身主干静脉均可发生DVT，但多见于下肢。据报道左下肢更易发生 DVT[6]。但由于大鼠股静脉较细，股动、静脉粘连紧密，选择大鼠股静脉很难成功造模，故多选用下腔静脉替代股静脉作为首选造模血管[7]。观察本实验术后6h和1、3、7、10、14 d不同时点的动物模型组病理演变过程，无论是家兔动物模型还是大鼠动物模型均符合人体下肢静脉血栓形成急性期病理演变[2]。完全可以用于动态研究药物对深静脉血栓形成(DVT)作用机制。

本研究采用简易悬吊术，以大鼠、家兔为实验动物制备深静脉血栓模型，结果显示大鼠、家兔动物模型下腔静脉内均可形成稳定的血栓，成功率高，均符合人体下肢静脉血栓形成急性期病理演变特点。形成血栓的动物模型中，无论大鼠、家兔的存活率均较高，能满足实验要求，两者无显著性差异。将大鼠模型和家兔模型做一比较，家兔模型有如下优势：①造模操作相对容易：在造模过程中，大鼠的动静脉连接异常紧密，操作相对困难，血栓形成后大鼠下肢肿胀度持续时间较长。家兔对应段动静脉间间隙相对较松，实验操作相对容易。因此家兔模型比大鼠模型操作更简单，更适用。②家兔模型形成的血栓长度明显较大鼠模型长，易于采集。③家兔模型血液的抽取更容易，血量明显多于大鼠模型。

总之，简易悬吊术可以成功制作适合动态研究药物对深静脉血栓形成(DVT)作用机制的的家兔或大鼠深静脉血栓模型，家兔更适应于该方法造模。

图1　悬吊下腔静脉

图2　悬吊松紧判断

图3　HE染色×100

图4　HE染色×100

[1] 张惠明,张力.简易悬吊术制备大鼠深静脉血栓模型[J].现代中西医结合杂志,2009,18(17):1979-1989.

[2] Reyers I,Mussoni L,Donati MB,et al. Failure of aspirin at different doses to modify experimental thrombosis in rats[J].ThrombRes,1980,18(5):669.

[3] 赛力克·马高维亚,王护国,罗军,等.一种适合动态研究的大鼠深静脉血栓动物模型[J].中国普外基础于临床杂志,2008,15(6):408-411.

[4] 陆慰萱,刘春萍.深静脉血栓形成和肺血栓栓塞症的自然病程[J].中华医学杂志,2003,83(1):84.

[5] 高峰,胡建国,关薇薇.SD大鼠深静脉血栓模型的建立及其静脉壁形态学研究[J].江西医学院学报,2008,48(2):25.

[6] 李晓强,桑宏飞.下肢深静脉血栓形成的外科治疗[J].中国普外基础与临床杂志,2006,13(6):638.

[7] 刘政,侯玉芬,周涛.深静脉血栓形成动物模型的建立及应用进展[J].中国中西医结合外科杂志,2005,11(5):451.

Research summary simple suspension for preparation of rabbit and rat model of deep vein thrombosis

Objective: Using simple suspension for preparation of rabbit and rat model of deep vein thrombosis. At the same time, compared the model rats with rabbits ,explore simple suspension is a kind of simple and suitable for dynamic study of deep vein thrombosis (DVT) modeling method, rats and rabbits which animals is more suitable for the modeling method. Methods: Selection of 36 weighing (250±20) grams of SD rats and 42 weighing (2.5±0.5)grams of cleaning stage rabbits .The rabbits were divided into animal model group and sham operation group with random digits table method. Rats served as control group. The animal model group and the control group were prepared by simple suspension operation. To observe the pathological changes of the vascular intima and blood clots in different time points after model prepared. The rat model and the rabbit model compare observed and compared with sham operation group do. Results: After preparing model using simple suspension, not only did rat model and rabbit model animal inferior vena venous formed stable thrombus, but also the formation of thrombosis animal survival rate was relatively high, in line with the human vein thrombosis in acute stage of pathological evolution. The rabbit model is more simple than rat model. Conclusion: Simple suspension can be successful for the production dynamics of drugs on the formation of deep venous thrombosis (DVT) mechanism in the rabbit or rat deep vein thrombosis model, rabbit is more suitable to the method of modeling.

Simple and easy ventrofixation;rabbit;rats;deep vein thrombosis

R-33

A

1008-1151(2015)07-0081-03

2015-06-10

广西自然科学基金（桂科自0991167）。

覃锋（1984－），女，广西中医药大学第一附属医院主治医师，中医外科学硕士，从事周围血管疾病的诊疗。

张力（1964－），男，湖南醴陵人，广西中医药大学第一附属医院主任医师，从事周围血管疾病的中医及中西医结合诊疗及基础研究。