烟农专业合作社财务管理规范化研究——以湖南省41家示范社为例

丁快快，刘文丽,3，曾尚梅,3，肖春生，李伟

1湖南农业大学商学院，湖南省长沙市 410128；

2中国烟草总公司湖南省公司，湖南省长沙市 410004；

3湖南涉农企业发展研究中心，湖南省长沙市 410128

蔡联合1, 陈媛媛2, 谢小东3, 魏攀3, 张剑锋3, 王忠3,李锋3, 魏春阳3, 王燃3, 武明珠3, 罗朝鹏3 ,杨军3，林福呈3

1 广西中烟工业有限责任公司，南宁市北湖南路28号 530001；

2中原工学院，新郑双湖经济开发区淮河路1号451191；

3中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

烟农专业合作社财务管理规范化研究
——以湖南省41家示范社为例

丁快快1，刘文丽1,3，曾尚梅1,3，肖春生2，李伟2

1湖南农业大学商学院，湖南省长沙市 410128；

2中国烟草总公司湖南省公司，湖南省长沙市 410004；

3湖南涉农企业发展研究中心，湖南省长沙市 410128

在湖南省41家示范社问卷调查与实地访谈的基础上，对示范社在财务管理制度、财会人员、会计核算、审计与监管、成员的合法权益保障等财务管理工作内容中出现的现象做了概括性总结和原因分析，最后提出实现财务管理工作规范化的合理建议。

烟农专业合作社；财务管理；会计核算；审计

通过文献检索发现，国内对烟农合作组织常见的叫法有烟草合作社、烟叶生产合作社、烤烟专业合作社等等，尚未形成一致的称呼，因此在本文中统一使用“烟农专业合作社”称呼（以下简称合作社）。烟农专业合作社是指在烟田家庭承包经营的基础上，烟叶生产者自愿联合、自主管理、自我服务、统分结合、双层经营的烟农专业合作经济组织[1]。湖南是农业大省，也是烟草农业大省，烟叶生产是湖南烟叶产区农民脱贫致富、地方财政增收的重要经济来源。而烟农专业合作社已具备制度创新[2]，因而大力发展合作社是发展现代烟草农业的必然要求，是保持烟叶生产健康发展的迫切需要，对促进湖南农业结构调整，推进山区经济的发展有着至关重要的意义。

随着湖南烟农专业合作社的蓬勃发展，合作社规模和收入不断增加，其财务管理工作中的问题也层出不穷，在一定程度上制约着合作社的健康发展。财务管理作为合作社规范化建设的基础和核心,对保证合作社的可持续发展至关重要[3]。规范合作社的财务管理工作有利于促进合作社健康发展，有利于保障成员合法权益，势在必行。为此，课题组于2014年3月对湖南省烟农专业合作社2013年度财务管理工作展开了实地调研与分析，涉及湖南省10个市州、31个产烟县、41家示范社。

1 湖南烟农专业合作社财务管理存在的问题及原因

2013年全省烟农专业合作社由原有的247家整合为125家，其中示范社有41家，占合作社总数的32.8%；级别为行业示范社的有12家，占示范社总数的29%；级别为省级示范社的有29家，占示范社总数的71%。数据显示，其中32.8%的合作社能够适应示范社建设的要求，在民主管理、专业化服务效果等方面为其他合作社树立了典型模范，同时也得到了烟草部门和各级财政的支持，能够比较健康地发展。据统计，全省2013年41个示范社的总收入达26599万元，扣除各项支出24172万元之后，盈余2427万元，社均收入648.76万元，社均盈余59.20万元，共返还给烟农成员的盈余1562万元，户均达到580元。但是，从调研结果中发现，示范社在财务管理工作中还存在一些突出问题。

1.1 财务管理制度不健全，执行不到位

示范社基本上依照《农民专业合作社法》的规定成立，制定章程，设立三会：理事会、监事会、成员（代表）大会，内部管理制度、财务管理制度等。但是，部分示范社没有建立在章程指导下的与合作社业务相对应的实用财务管理制度，比如票据管理制度、资产管护制度、成员账户管理制度等。实际情况如下：

表1 湖南省41家示范社财务管理制度设立情况Tab.1 Financial management system in 41 model cooperatives of Hunan province

由于财务制度不健全，造成30%左右示范社的财务管理工作混乱，如白条入账、会计信息质量失真等现象屡屡发生，盈余分配方案的决定以及财务公开等重大问题缺乏民主监督，只关注费用的报销、审批，不强调资产管理、收入管理和往来款项、经济业务的监督等。

11家示范社有较完善的财务制度并将制度装框挂在办公室醒目的位置，但没有严格执行到位。如：2家合作社忽视货币资金管理制度的规定，任意金额的交易都通过现金完成，还有3家合作社存在记账人员代替出纳人员工作的现象等等。深究其原因：一是合作社的管理人员和普通成员自身素质不高和能力不足；二是合作社侧重经营业务、轻财务管理的问题比较突出，对财务制度存在较大的抵触情绪。三是合作社负责人的小农意识表现愈显突出，他们安于现状，凭经验而不是根据会计信息作决策，害怕“露富”，也不愿意公布会计信息和接受会计监督[4]。这些因素都制约合作社财务管理制度的实施，造成合作社经营的不稳定性，扩大了经营风险。

1.2 财会人员素质参差不齐

由于合作社大多地处偏僻，工作条件有限，合作社很难找到业务水平较高的财会人员，因此传统的流水账在合作社中还比较普遍。同时，合作社能给财会人员的薪酬远低于同地区的企业，财会人员的流失现象日益严重，使得会计资料保管不善，进而使得财务数据衔接不上而影响会计信息质量。据调查，98.4%的合作社都是委托农村经营管理机构或财政所代理记账，这些合作社一般是一个月或者一个季度进行一次账务处理，会计核算没有及时进行，从而导致形成的会计信息不完整、不真实。另外，现阶段为合作社代理记账的会计人员以前都是从事企业会计工作，不熟悉合作社财务会计制度，这些兼职会计也不常驻合作社，对合作社业务不熟悉，年龄也普遍较大、接受新知识能力较弱，从而造成目前合作社普遍存在会计业务水平不高的现象。对财会人员的调研结果显示如表2和表3，数据表明烟农专业合作社的财会人员专业化水平整体偏低，这显然不符合合作社未来发展的需要。

表2 湖南省41家示范社财会人员学历分布Tab.2 Education degree of accountants in 41 model cooperatives of Hunan province

表3 湖南省41家示范社财会人员技术职称Tab.3 Technical title of accountants in 41 model cooperatives of Hunan province

1.3 会计核算不规范

1.3.1 会计基础工作“四不规范”

会计基础工作质量的好坏直接影响合作社后续会计核算工作。合作社会计基础工作问题主要体现在“四不规范”上：

原始凭证不规范。一是合作社存在大量白条入账，其原因一方面是烟农合作社在提供专业化服务中，合作社作为专业化服务提供方未能开具发票，另一方面是合作社为降低成本，没有索取发票，或者以出售方无法提供正式发票为由，仅以手写的白纸黑字代替正式发票，从而无法真实核算生产经营成本。二是取得的原始凭证不合规，如银行进账单和现金缴款单回单上所盖的业务办讫章无日期；不同日期的业务所取得的收据的编号是连续的；永州1家示范社有自制的原始凭证但填写内容不完整，如现金入股时缺少合作社财务专用章。三是原始凭证审批手续不规范，相关责任人不全，有的经办人、审批就是同一个人。

会计科目使用不规范。一方面是合作社未按《农民专业合作社财务会计制度（试行）》的规定设置会计科目，而是沿用《企业会计制度》规定的会计科目。如以“其他应收款”代替“成员往来”，以“实收资本”代替“股金”等等。另一方面是有关会计科目之间的核算内容互相混淆。如：1家示范社将烟草部门补贴投入的实物记入“资本公积”科目，而按照合作社会计制度规定，应计人“专项基金”科目，而不应记入“资本公积”。

记账凭证不规范。摘要不清晰，内容不完整，凭证要素不齐全，部分编号不连续，54%的示范社只有记账，没有制单，更没有审核。如1家示范社的一笔业务是工行对公的扣款，银行回单的金额是60万元，而记账凭证记录的金额为72.67万元。还有少数合作社的记账凭证编制不及时，如1家示范社经济业务已发生了2年，因业务量较少，合作社会计就选择在一个年度编制记账凭证，这就违反了会计分期假设，造成会计信息失效的后果。

会计账簿不规范。合作社没有按要求购置会计账簿，或没有按要求设置和使用会计账簿，例如：1家示范社的现金日记账、银行存款日记账、总账连续几年使用同一本账簿，1家示范社的现金、银行存款日记账没有分设，用一本流水账记录。示范社“五账”不全，即总账、明细分类账、现金日记账、银行日记账和固定资产明细账不全，有1家示范社甚至出现有表无账情况。对账不及时；在进行错误更正时不按要求，存在挖、刮、补现象；月、季、半年、年终合计、累计、结转不规范。

1.3.2 重点会计核算内容不完善

成员往来核算不完善。与企业和事业单位相比，合作社在成员构成、业务往来、盈余分配和公积金量化等具体会计核算事项有其独特性，因此要重视成员往来的核算[5]。示范社成员往来的核算突出的问题主要有四种：一是2家示范社没有设置成员账户。二是设置了成员账户，但成员账户的内容记载不完整。根据《综合服务型烟农合作社建设指南》的规定，成员账户应记录五个方面的内容，而调研结果显示，大约65.9%的示范社成员账户同时包含五个方面的内容，其他合作社的成员账户只记录部分内容或者只有该成员与本社的交易量（额）。三是设置了成员账户，但是没有按照规定进行账务处理。如：1家示范社共有3个成员，根据章程规定A、B、C出资额分别为10万元、5万元、5万元。2月2日，收到A、B两个成员的出资额，共150000元，C的出资额于3日支付。在处理该种业务时，合作社没有通过成员往来账户进行反映，认为应该通过“应收款”账户对未付款进行处理，将会计分录错误地写成：借：银行存款150000，应收款一成员C50000；贷：股金一各成员200000。正确账务处理步骤应为：①在工商登记时，应该根据出资清单和合作社章程明晰股权，做如下会计分录：借：成员往来一各成员200000；贷：股金一各成员200000；②在收到A、B两个成员的出资额时，根据银行进账单，做如下会计分录：借：银行存款150000；贷：成员往来一A、B成员150000；③在收到C交款后的银行进账单后，做如下会计分录借：银行存款50000；贷：成员往来一成员C50000。四是现阶段成员账户设计的格式不科学，记录工作量大，造成了大量的人力财力物力耗费，还不便于查找合作社与成员的详细业务往来。

成本核算过于简单化。一是合作社产品物资的收发不计量、不登记，对后续成本核算工作造成基础性的影响。二是有半数以上合作社未以成本核算对象和成本项目作为生产成本的明细科目归集生产费用。如1家示范社综合利用设施种植西瓜、蘑菇、木耳三种作物，分别投人种子、化肥、农药、人工等。在核算时，各种农作物混淆，只记农作物，或者以设施综合利用作为明细科目归集费用，或者将多种农作物共同发生的生产费用全部记在某一种作物上。三是按照收付实现制核算，而没有按权责发生制进行，造成总成本不正确，致使当年成本虚高虚低现象。造成以上问题的原因是合作社经营管理者管理水平低，对成本核算工作缺乏重视，以及合作社会计较低的专业素质而只能选择传统的简单做法。

盈余分配核算背离“社员惠利”原则，分配乱象丛生。在盈余分配核算方面存在的问题主要有四种：一是由于合作社盈余分配制度不健全，普通成员被排斥在合作社盈余分配的范围之外。二是盈余分配的项目及提取的程序不规范。烟农专业合作社还处于发展的初级阶段，盈余分配的提取缺乏合理的标准章程，因而提取盈余分配的各个项目并不全面。数据显示，提取盈余公积的示范社数量为38个，占比为92.68%；提取公益金的示范社数量为19个，占比为46.34%；提取资产管护经费的示范社数量为28个，占比为68.29%。同时，合作社在盈余分配各项目提取程序上比较随意，从合作社负责人得知，如公共积累的提取大多数都是按照本合作社的盈余随意提取的。三是合作社存在盈余分配的比例偏低，盈余返还不及时、不透明的情况，成员从合作社获得的实惠并不明显。从调研数据中得知，2013年有盈余的示范社为41家，其中对社员有盈余返还的有 35家，没有盈余返还的有6家，后者占示范社总数的15%。盈余返还比例在35家示范社中也极不平衡，最低的返还比例仅为可分配盈余额的16.36%左右，最高的返还比例达到100%。四是合作社只分配一次，而没有按照章程进行第二次分配核算。如：1家示范社2013年盈余5万元，2012年未发生亏损，提取盈余公积0.5万元。合作社便只进行了一次盈余分配，会计分录如下：借：盈余分配一各项分配盈余返还 27000；贷：应付盈余返还一各成员 27000。其实，实行二次分配的初衷是在产中和产后的专用性投资保护中寻找一个平衡，交易量（额）返还，侧重于保护农产品生产环节的农户专用性投资；股金分红，侧重于保护资金和技术所有者产后环节的专用性投资[6]。因此，合作社会计在进行了第一次分配后，应该紧接着进行第二次分配即剩余盈余返还，并做如下会计分录：借：盈余分配一各项分配（剩余返还）18000；贷：应付剩余盈余一各出资成员18000。造成以上问题的原因有：合作社盈余分配的决策权过于集中；管理者对合作社的普惠宗旨理解不到位；成员账户的编制不完整；社员对盈余分配缺乏了解；合作社会计专业素质低。1.3.3 会计报表编制不合理。

在会计报表方面存在的问题主要有以下三种：一是6家示范社按照小企业会计制度编制了资产负债表、利润表、现金流量表，而没有按照合作社会计制度的要求提供资产负债表、盈余及盈余分配表、成员权益变动表等。二是80%左右的示范社在年度终了时除编制了资产负债表和盈余及盈余分配表外，其他会计报表却未能按要求编制。三是部分示范社编制的会计报表的内外勾稽关系不准确，资产负债表、盈余及盈余分配表和成员权益变动表之间相同项目的期末余额不相等。造成以上问题的原因有：一是合作社管理层还没有明确烟农专业合作社与小企业是存在区别的；二是现阶段合作社会计以前都是从事企业会计工作，习惯于做小企业报表；三是部分地区税务专管员要求合作社按小企业会计报表报税；四是现阶段合作社会计专业素质普遍较低，难以准确、完整地编制会计报表。

1.4 审计流于形式，各方监管乏力

在合作社，监事会是监督理事会执行成员代表大会决策的监督机构，并负责合作社内部审计工作。在调研过程中发现，合作社虽然推行民主管理，非营利经营，但治理层和监管层可能会因利益而合谋，此时监事会的监管基本上流于形式，如果没有独立的外部审计机构的监督，合作社的民主经营、民主管理将无从谈起。

表4 湖南省41家示范社审计工作实施情况统计表Tab.4 Auditing condition in 41 model cooperatives of Hunan province

数据显示，仅提供内部审计报告的示范社有23家，占总数的56%；既提供内部审计报告又提供外部审计报告的示范社仅1家，占总数的2%；两者都没有提供的示范社有17家，占总数的42%。另外，合作社所提供的审计报告都没有提出整改意见或者建设性的意见，90%都是一般描述性的分析，也没有将审计结果向成员大会（代表大会）报告，接受成员监督。

各方监管乏力的原因主要有：第一是烟草部门对会计信息的非有效需求，对合作社的财务没有进行监督和审计；如1家示范社会计核算不规范，也照样从烟草部门得到补贴资金。第二是地方财政部门、农村经营管理部门以及烟草部门相互推诿管理和指导责任；第三是合作社普通成员不了解《农民专业合作社法》和《农民专业合作社财务会计制度(试行)》，无法利用会计信息来保障自己的合法权益，从而使得合作社会计信息供给失去信息需求和成员监督，如部分示范社的成员（代表）大会并不以会计信息为依据表决重大事项，而是由核心成员说了算。

2 规范湖南烟农专业合作社财务管理工作的建议

2.1 提高管理者水平，健全财务管理制度

首先，需要加强对合作社管理人员的培训力度，增强管理人员的法律规章意识、规范管理意识。其次，农民专业合作社能否成功运转,关键看它的内部运行机制,而财务管理制度是内部机制有效运行的重要保证[7]。因此，合作社管理者应依据相关法律法规，并结合实际情况，建立健全财务管理制度。从合作社的实际需要出发，健全的财务管理制度应包括如表1中的13种。同时，烟草部门和其他政府部门在评选合作社示范社或者发放补贴扶持资金时，应将财务管理制度的建立、健全以及执行作为考核的核心指标，从而敦促合作社达到要求。

2.2 培养一批财务业务一体化的财会人员

财务管理要走向规范化，就离不开一批既懂业务又懂财务的财会人员，因为财会人员才是财务工作的具体执行者。财会人员的建设要充分利用社会各界的资源，应联合烟草部门、农业院校以及合作社进行财会人员建设。另外，由于财务业务一体化的目标以及高技术人才和大学生群体对合作社认知程度低且没有归属感，所选取培养的财会人员应出自合作社内部。

2.3 依法完善会计核算内容，提高会计核算水平

2.3.1 扎实规范会计基础工作，坚实会计后续核算基础

合作社要严格按 《会计法》、《农民专业合作社财务会计制度（试行）》的规定，从各方面落实会计核算基础工作。一是原始凭证必须具备齐全的要素，填写准确，才能制单，另外坚决抵制白条入账。进一步规范原始凭证的“三性”即合法性、合规性、合理性审查。二是严格按照规定设置和使用会计科目。三是记账凭证要如实根据原始凭证反映的经济信息填制，同时实现各要素以及记账、制单、审核都要齐全。四是健全会计账簿，账簿登记要及时明了，对账、错账更正、结账要有条不紊进行，最终实现“四相符”即账款相符、账物相符、账证相符、账表相符。

2.3.2 完善重点会计核算内容，提高会计信息质量

《农民专业合作社法》第三十六条明确规定,农民专业合作社应当为每个成员设立成员账户。因此，合作社要依法且科学合理地设立成员账户，并准确、完整记载五个方面的内容，保障成员的合理利益，提高成员的积极性。要完善合作社的成本核算应当建立健全存货内部控制制度，建立保管人员岗位责任制。其次，成本项目的归集与分配应考虑合作社的自身特点与管理需要[8]。为了直观反映某产品或专业化服务的总成本及其具体项目的开支情况，应以产品或专业化服务名称作为二级明细科目，如大白菜、育苗、植保等，以费用项目作为三级明细科目，如种苗费、肥料费、农药费、人工费用等。再次，应正确划分各项费用支出界限。最后，合作社应严格按照要求进行正确的账务处理。分配制度实质是合作社的灵魂，它既是社员参与社内交易的核心激励手段，也是合作社吸引非社员加入的关键制度安排[9]。因此，合作社应结合自身的特点和《农民专业合作社法》的规定，以“社员惠顾返利”原则完善盈余分配制度，规范分配标准，优化盈余分配的比例，按时召开成员代表大会。

2.3.3 统一标准，优化会计报表编制

合作社会计须按照《农民专业合作社财务会计制度(试行)》的规定准确、完整地编制资产负债表、盈余及盈余分配表、成员权益变动表、科目余额表和收支明细表、财务状况说明书等，并及时报送相关部门。财政部门、农村经营管理部门以及烟草部门应以合作社是否提供符合要求的会计报表作为合作社获取补贴和项目的重要条件之一。

2.4 内外部审计双管齐下，各方力量齐抓共管

采用内外审计结合的方式加强对合作社的审计监督。一方面，要求合作社设立监事会，由其负责对本社财务进行内部审计，并将审计结果向成员（代表）大会报告；另一方面，为了防止在经营过程中可能因利益问题致使治理层和监管层利益合谋，使监事会的监管作用无法发挥，还必须借助外部独立的审计机构。此外，财政部门依照《会计法》的规定职责，对合作社的会计工作进行管理和监督；农村经营管理部门和烟草部门则合作构建一份湖南省烟农专业合作社绩效评价指标体系，每年对全省合作社的绩效进行考核，比较不同合作社的经营管理水平，并提出整改意见；建立普通成员对合作社监督的上报机制，同时加强对普通成员的培训来提高其素质，从而提高普通成员的监督意识。

2.5 探索建立湖南省烟农专业合作社信息服务平台

省烟草部门和农经部门可以借鉴上海市新型农业经营主体信息管理系统的经验来探索建立湖南省烟农专业合作社信息服务平台，包括合作社信息网上公开、综合利用产品电子商务、成员远程培训、会计电算化管理、合作社绩效考核等综合管理服务功能，全面实现合作社经营、销售的信息化，从而带动合作社财务管理的制度化、规范化、信息化的建设。

2.6 矫正“重数量，轻质量”的示范社建设路径

在合作社发展的现阶段,由于急功近利、较低的文化素质以及经验的缺乏, 合作社管理者大多以本行业的模范合作社为标杆,简单模仿或照搬示范社的整个发展过程。因此, 各级烟草部门要按照“高起点、高标准、高效益”的要求，科学制定标准，严格评定程序，强化动态管理，重点指导扶持，扎实推进合作社示范社建设工作。需要强调的是，“示范社”不一定是规模最大发展最好的合作社,而是在烟草行业各发展阶段下具有一定代表性的合作社。

[1]黄祖辉,高钰玲,邓启明. 农民专业合作社民主管理与外部介入的均衡——成员利益至上[J].福建论坛(人文社会科学版),2012,02:44-48.

[2]戴成宗,何轶,杨双剑等.烟农专业合作社发展探析[J].中国烟草学报,2012,02:82-87.

[3]任坐田.农民专业合作社财务管理规范[J].经济管理,2006,19:87-89.

[4]卢新国.农民专业合作社财会制度实施难的原因及对策[J].统计与决策,2009,22:76-78.

[5]王晓芊.关于完善农民专业合作社成员账户及其会计科目的思考[J].农村经济,2010,09:128-129.

[6]王玉华. 当前农民合作社财务管理存在的问题及改进措施[J].农业经济,2015,02:93-94.

[7]余艳锋,罗青平,戴天放等.构建适宜我国农民专业合作社特征的财务管理制度[J]. 农村经济,2009,01:126-129.

[8]李视友.浅议农民专业合作社农产品成本核算[J].财会月刊,2013,09:52-53.

[9]王丽敏.农民专业合作社会计制度规范化的现实思考[J].农业经济,2009,12:52-53.

:DING Kuaikuai, LIU Wenli, ZENG Shangmei, et al. Study on standardization of financial management in tobacco farmer cooperatives: taking 41 demonstration cooperatives in Hunan province as examples [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(6)

生物技术

烟草脉带花叶病毒基因组序列分析

蔡联合1, 陈媛媛2, 谢小东3, 魏攀3, 张剑锋3, 王忠3,李锋3, 魏春阳3, 王燃3, 武明珠3, 罗朝鹏3,杨军3，林福呈3

1 广西中烟工业有限责任公司，南宁市北湖南路28号 530001；

2中原工学院，新郑双湖经济开发区淮河路1号451191；

3中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

摘 要：为了探明烟草脉带花叶病毒危害和流行的机制，使用RT-PCR技术扩增获得TVBMV云南分离物YN9.1基因组全序列，并进行了基因组结构、序列同源性、氨基酸保守基序、系统进化和重组分析。结果表明：（1）YN9.1基因组具有Potyvirus属病毒典型特征，含有在Potyvirus属病毒中较为少见的NIb/CP切割位点Q/N；（2）YN9.1与其它分离物核苷酸序列同源性为90.5-91.1%，氨基酸序列同源性为95.2-96.2%。与YND核苷酸和氨基酸序列同源性最高；（3）对HC-Pro和CP保守基序进行了分析。YN9.1具有RITC、PTK、DAG等病毒蚜虫传播保守基序，其中RITC在Potyvirus属病毒中常见形式为KITC；（4）系统进化树分析结果显示，TVBMV进化形成2个组，云南分离物独立进化形成一组，TVBMV进化与地域具有明显的相关性；（5）重组分析发现PY为ZC1和YN的组内重组体，重组位点位于HC-Pro 3’末端和NIb 5’端。

关键词：烟草脉带花叶病毒；保守基序；序列分析；进化分析；重组分析

引用本文：蔡联合, 陈媛媛, 谢小东,等. 烟草脉带花叶病毒基因组序列分析[J]. 中国烟草学报，2015,21（6）

作者简介：蔡联合(1982—)，农艺师，从事烟草原料、仓储及加工等方面研究工作，Tel：0771-8098546，Email：cailianhe12@163.com

通讯作者：罗朝鹏(1981—)，工程师，主要从事烟草病毒分子生物学和防治技术, 以及烟草分子生物学研究，Tel: 0371-67672307，Email: zhiwubingdu@sohu.com

收稿日期：2015-01-05

烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)为马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒。病毒粒体为弯曲线状，长度约为780nm，直径约为15nm[1]。该病毒主要通过蚜虫以非持久性方式传播，只侵染茄科植物。在苋色藜(C.amaranticolor)和昆诺藜(C.quinoa)叶片上产生枯斑，系统侵染本氏烟(N.benthamiana)、普通烟(N.tobacum)、番茄(L.esculentum)、曼陀罗(Datura stramonium)等[1,6,7]。烟草感染TVBMV后叶片表现为沿叶脉的带状绿岛和深绿色斑块症状[2,8]。TVBMV曾给台湾和美国等地区的烟叶生产造成严重威胁[8-10]。近年来，TVBMV在我国多个主产烟区均有发生。1989-1991年进行的“全国烟草侵染性病害调查研究”项目研究结果表明，TVBMV只在福建、广东和山东发现，为偶发病害[3]。其后的研究发现，TVBMV在贵州已经发展为次要病害[4]。近年来，TVBMV在我国云南、河南、山东等烟叶主产区的发生和危害呈上升趋势[5,11,12]。由于田间症状与马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y, PVY)相似，因此，TVBMV给我国烟叶生产造成的损失可能被大大低估[11]。

TVBMV基因组研究较晚。1994年，2个研究组分别报道了TVBMV基因组3’末端部分序列[13,14]，但直到2007年，首个基因组才被测定[6]，2010年测定了第二个基因组全序列[12]。在基因组研究的同时，TVBMV系统进化和分子变异研究已经开展。Tian报道了TVBMV 12个中国分离物3’-末端部分序列，根据CP基因进化关系，将其分为3个组。并且发现TVBMV基因组存在重组现象[11]。Zhang测定了40个中国分离物不同区域基因序列，根据这些区域，可以分为地域相关的2-3个组。分析发现在这些分离物中31%为重组体[15]。Yuan测定了10个TVBMV基因组序列，深入分析发现TVBMV可以分为不同的亚组，并且在10个分离物中有3个为重组体[16]。TVBMV在我国烟叶主产区的危害不断上升，在此背景下，本文从云南烟区烟草样品中获得一株新的TVBMV分离物，在基因组水平进行了生物信息学分析，明确了该分离物基因组序列特征，系统进化关系和TVBMV重组株系及重组株系基因组组成。基因组水平的研究，对于明确TVBMV危害和流行的机理，进而制定针对性的防治措施具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 植物材料及试剂

病毒感染的烟草叶片采自云南烟区，采集时间为2012 年7月，经过ELISA检测后保存于-80度冰箱。

AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、XL10-Gold感受态细胞、DNA聚合酶、pBLUE -T载体、GenePure Gel Purification Kit、GenePure Plastid Mini Kit、SuperPure Plantpoly RNA Kit和DNA标准分子量均购自郑州安赛生物科技有限公司。其它试剂均为进口或国产分析纯。引物合成和测序在北京六合华大基因科技股份有限公司进行，引物见表1。

表1 基因组扩增引物Tab.1 Primers used to ampli fi ed genomic sequences of TVBMV

1.2 方法

1.2.1 基因组扩增

TVBMV基因组扩增体系参考DNA聚合酶说明书。PCR扩增条件为： 94℃ 3min；94℃ 30s，55℃30 sec，72℃ 1.5min；30次扩增循环；72℃10min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的片段。连接pBLUE -T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，PCR鉴定阳性克隆后，测序。

1.2.2 序列分析

使用DNAMAN(version 6)软件进行序列拼接；同源序列检索使用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[17]进行。核酸和蛋白序列多重比对使 用CLUSTAL W2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)[18]和Bioedit[19]软件。利用MEGA5 (Version 6.06)软件中的相邻连接方法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统进化树。

1.2.3 重组分析

重组分析使用RDP4软件包(Version 4.33)，包括 RDP、GENECONV、BOOTSCAN、MAXCHI、CHIMAERA、SISCAN和3Seq等不同分析方法。至少有4种方法支持，且P值＜10-6时，认定为可信的重组。RDP4软件以默认参数运行，P值为0.05，窗口大小为10.

2 结果与分析

2.1 YN9.1基因组结构分析

YN9.1具有Potyvirus属病毒典型结构，基因组为单链正义RNA分子，基因组由5’非翻译区(5’ Untranslated region, 5’-UTR)、 单 一 开 放 阅 读 框(Open reading frame, ORF)和 3’非 翻 译 区 (3’-UTR)组成，其中基因组5’端共价结合有NIa-Vpg，3’-端具有Poly(A)尾。基因组全长9570nt。其中5’-UTR长 146nt，3’-UTR 长 184nt。ORF 位 于基因组 147-9386，长9241nt，编码的多聚蛋白长度为3080aa，计算的分子量为348.9kDa。YN9.1序列已经登录GenBank，基因组序列登录号KF444434，多聚蛋白登录号AGZ95140。

多聚蛋白经自身切割后，生成10个成熟的蛋白，分别为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、CP。最新研究发现，P3基因内部通过移码，还编码一个新蛋白PIPO，长度约60aa[20,21]。11个蛋白的基因长度和蛋白分子量依次为(图1)：P1基因长924nt (147-1070)，蛋白分子量为 35.3kDa；HC-Pro 1374nt (1071-2444)，52.1kDa；P3 1041nt(2445-3485)，40.4kDa；PIPO 180nt(2912-3091), 6.5kDa; 6K1 159nt (3486-3644)，6.2kDa；CI 1932nt(3645-5576)，71.9kDa；6K2 159 nt (5577-5735)，6.0kDa；NIa-VPg 570nt (5736-6305)，21.3kDa；NIa-Pro 726nt (6306-7031)，26.8kDa；NIb 1539nt (7032-8570)，58.5kDa；CP 813nt (8571-9386)，30.6kDa。除PIPO外，其它蛋白的切割位点分别为Y/S、G/G、Q/A、Q/S、Q/S、Q/G、E/A、Q/S和Q/N，其中NIb/CP的切割位点为Q/N，与同样来自云南的YND分离物一致[6],而河南分离物HN39切割位点为Q/G[12]。在Potyvirus属中，NIb/CP常见切割位点为Q/G[22]。

图1 TVBMV基因组结构示意图Fig.1 Schematic representation of the TVBMV genome

2.2 TVBMV序列同源性分析

使用YN9.1基因组序列进行Blast检索，共检索到12个TVBMV基因组序列。序列分析显示(表2)，YN9.1与其它分离物基因组核苷酸序列同源性为90.5-91.1%，多聚蛋白氨基酸序列同源性为95.2-96.2%。不同区域，5’-UTR变异最大，同源性最低，只有84.2%-87.6%。3’-UTR最保守，同源性最高，为95.1%-96.1%。编码蛋白的基因，PIPO、HCPro和CI变异较小，较保守。P1核苷酸和氨基酸序列同源性最低，变异最大。YN9.1与同样来自云南的YND分离物基因组核苷酸和氨基酸序列同源性最高，分别为91.1%和96.2%。但在HC-Pro、6K1和CI区域，YN9.1与HN39分离物核苷酸和氨基酸序列同源性最高。YN9.1与YND PIPO核苷酸同源性最高，但蛋白同源性与几个山东分离物最高。与其它病毒比较，YN9.1与同属辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)同源性最高。

表2 YN9.1与其它分离物核酸和氨基酸同源性比较Tab.2 Nucleotide and amino acid identities between YN9.1 and other TVBMV isolates

2.3 YN9.1保守序列分析

与YND分离物一样，YN9.1基因组5’UTR也含有2个在Potivirus中高度保守的potybox‘b’(TCAAGCA)基序[23]，分别位于基因组序列23-29nt和80-86nt，但在HN39分离物中只有1个potybox‘b’。最新发现的PIPO蛋白，其编码序列5’端含有高度保守的G1-2A6-7基序，在YN9.1中，该基序为G1A6模式。研究发现，该基序与病毒运动相关[24]。

HC-Pro和CP是Potyvirus属病毒重要的功能蛋白。其功能涉及病毒蚜虫传播、病毒复制，病毒移动，寄主症状表现，抑制RNA沉默等。YN9.1 HCPro含有锌指结构域(zinc fi nger metal-binding motif)CGEVAGIICQSLMPCCRITCIQC。其中，RITC保守基序在病毒蚜虫传播过程中起关键作用[25]，该基序在Potyvirus属病毒中称为KITC，其它形式有K/R-I/L-T/S-C[6,25-27]。PTK也是病毒蚜传关键基序[28]。FRNK基序与寄主的症状表现[29]和RNA沉默有关[31]。IQN是病毒基因组复制所必须的[31]。在CP中，DAG是涉及病毒蚜虫传播的关键基序，该基序通过与PTK互作，调节病毒的蚜传活性[32]。

2.4 系统进化分析

根据基因组核苷酸序列NJ系统进化树的分析结果 (图2)，13个TVBMV分离物进化形成2个组，I和II。I组11个分离物全部来自河南和山东。II组只有两个分离物，YN9.1和YND，均来自云南。可见，YN9.1和YND亲缘关系最近，而且TVBMV分组与地理区域具有明显的相关性。

图2 TVBMV基因组序列系统进化树Fig. 2 Phylogenetic trees of TVBMV based on genomic sequences

2.5 重组分析

根据全基因组序列重组分析结果，在13个TVBMV分离物中，只有PY为重组体，各方法的 P值 分 别 为 RDP 2.515×10-18、GENECONV 7.318×10-18、BOOTSCAN 1.719×10-9、MAXCHI 4.317×10-16、CHIMAERA 2.711×10-13、SISCAN2.767×10-14和 3Seq 7.338×10-27. 该重组分离物的2个亲本分别为ZC1和YN，重组重组位点位于基因组序列2352和7067，处于HC-Pro 3’末端和NIb 5’端(图3)。根据进化分析结果，这两个亲本均为I组分离物，因此PY为组内重组。

图3 PY基因组序列重组区域示意图Fig. 3 Bar presentation of PY recombination

3 结论与讨论

成功克隆到TVBMV云南分离物YN9.1基因组全序列。YN9.1基因组具有Potyvirus属病毒典型特征，含有较少见的NIb/CP切割位点。与YND核苷酸和氨基酸序列同源性最高，分别为91.1%和96.2%，但 在 HC-Pro、6K1和 CI区 域，YN9.1与 HN39分离物核苷酸和氨基酸序列同源性最高。YN9.1具有RITC、PTK、DAG等病毒蚜虫传播保守基序；根据系统进化树分析结果，TVBMV进化形成2个组，云南分离物独立进化形成一组，说明TVBMV进化与地域具有明显的相关性；重组分析发现PY为ZC1和YN的组内重组体，重组位点位于HC-Pro 3’末端和NIb 5’端。

在TVBMV系统进化分析中，所用基因区域不同，分组不同。根据HC-Pro和CP基因序列，TVBMV分为3组。根据P3和6K1基因序列，TVBMV分为2组[15]。Yuan的分析发现，根据HC-Pro、P3和6K1，TVBMV都分为2组，但组1都可以进一步分为不同的亚组。根据HC-Pro，组1分为3个亚组；根据P3和6K1，组1分为2个亚组。根据基因组序列，12个TVBMV分离物分为2组[16]，本研究研究结果与此相同。不同区域，分组不同，说明不同基因进化速度不同。在所有分组中，有2个共同的结论，1. 云南分离物都自成一组；2. TVBMV进化具有明显的地域相关性。

重组是病毒致病力分化和新株系产生的决定性因素之一[33]，重组在马铃薯Y病毒属病毒中发生较为普遍[34-37]。在TVBMV中，也发现有重组现象。Tian对TVBMV 3’-末端部分基因序列分析发现，ZB6为重组体，重组位于CP基因上[11]。根据HC-Pro、P3、6K1和CP基因序列，Zhang在42个TVBMV分离物中发现有13个重组体，重组位点处于HC-Pro和6K1基因上[15]。根据基因组序列，Yuan在12个分离物中发现YN、ZC和PY 3个为重组体，重组位点分别位于CI、NIb、HC-Pro、VPg和6K1基因上[16]。本研究对13个基因组序列的重组分析发现只有PY为重组体，重组位点位于HC-Pro和NIb基因上，与Yuan的结果稍有不同。

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Abstract：To gain insights into the damage mechanisms and prevalence of TVBMV， the complete genomic sequence of YN9.1 was determined by RT-PCR. The genome structure, sequence identity and similarity, conserved amino acid motif, phylogenetic and recombination analysis of YN9.1 were conducted. Results showed that （1）YN9.1 possessed typical genome characteristics of Potyvirus,and had a uncommon NIb/CP cleavage site of Q/N which was rare in potyviruses.（2）YN9.1 showed 90.5-91.1% nt and 95.2-96.2% aa identities with other TVBMV isolates, and shared the highest nt and aa sequence identity with YND. （3）Conserved motif in HC-Pro and CP of YN9.1 was analyzed, and the conserved motifs RITC、PTK and DAG were involved in aphid transmission. The motif RITC was the common form of KITC in Potyvirus.（4）Phylogenetic analysis showed that TVBMV isolates were divided into two evolutionary divergent groups, and isolates from Yunnan formed a separate branch, which revealed that TVBMV grouping was related to geographical origin. （5）The recombination analysis indicated that PY could be a intra-lineage recombinant, and had ZC1 as its major parents, and YN as its minor parent. The recombination sites were at the 3'end of HC-Pro and the 5'end of NIb.

Keywords:tobacco vein banding mosaic virus; sequence analysis; conserved motif; phylogenetic analysis; recombination analysis

Citation:CAI Lianhe, CHEN Yuanyuan, XIE Xiaodong, et al. Demarcating tobacco fi eld management based on GreenSeeker [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(6)

Study on standardization of fi nancial management in tobacco farmer cooperatives: taking 41 demonstration cooperatives in Hunan province as examples

DING Kuaikuai1, LIU Wenli1.2, ZENG Shangmei1.2, XIAO Chunsheng3, LI Wei3
1 College of Business, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China;
2 Hunan Provincial Tobacco Corporation, Changsha 410128, China;
3 Hunan Research Center for Development of Agricultural Enterprises, Changsha 410128, China

This paper reviewed and analyzed financial management system, working staff, financial accounting, auditing, supervision,protection of farmers' legitimate rights and interests in tobacco farmer cooperatives based on data collected by questionnaire and fi eld investigation. Suggestions were thus proposed to help standardize fi nancial management in such tobacco farmer cooperatives.

tobacco farmers' cooperatives; fi nancial management; accounting；audit

Analysis of genomic sequence in tobacco vein banding mosaic virus

CAI Lianhe1, CHEN Yuanyuan2, XIE Xiaodong3, WEI Pan3, ZHANG Jianfeng3, WANG Zhong3，LI Feng3, WEI Chunyang3,WANG Ran3, WU Mingzhu3, LUO Zhaopeng3, YANG Jun3, LIN Fucheng3
1 China Tobacco Guangxi Industrial. Co. Ltd., Nanning 530001, China;
2 Zhongyuan University of Technology, Zhengzhou 451191, China;
3 Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC, Zhengzhou 450001, China

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中国烟草总公司湖南省公司科技创新项目“湖南省烟农专业合作社运行机制与绩效评价体系研究与应用”（NO：14-15ZDBa08）；湖南省教育厅项目“现代农民专业合作社绩效评价体系研究”（NO：13A039）；湖南省社会科学基金一般项目“混合所有制下现代农民专业合作社内部控制体系优化研究”（NO：14YBA195）

丁快快（1990—），硕士研究生，主要研究现代烟草农业发展，烟农专业合作社的财务管理和绩效评价方面，Email:1064103915@qq.com

刘文丽（1968—），博士，教授，主要研究内部控制和风险管理方面，Email: 316124741@qq.com

2015-04-14