棉花黄萎菌病毒VdCV1 OTU蛋白的表达及纯化

2015-11-23韩守兵竺锡武

浙江农业科学 2015年3期

关键词：洗涤液电泳分子筛

韩守兵，张斯，竺锡武

（1.浙江理工大学生物工程研究所，浙江杭州 310018；2.湖南人文科技学院农业与生物技术研究所，湖南娄底 417000）

棉花黄萎菌病毒VdCV1 OTU蛋白的表达及纯化

韩守兵1，张斯1，竺锡武2*

（1.浙江理工大学生物工程研究所，浙江杭州 310018；2.湖南人文科技学院农业与生物技术研究所，湖南娄底 417000）

采用Gateway技术将棉花黄萎菌病毒VdCV1的OTU蛋白基因克隆至原核表达载体PET42-DEST中，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中诱导表达，然后通过镍柱亲和层析和分子筛纯化得到纯化的目的蛋白，并进行Western Blot检测。结果表明，BL21表达的OTU蛋白以包涵体形式存在，大小为97 ku。W estern Blot检测表明，His标签抗体能与97 ku左右的OUT-His融合蛋白特异性结合。

OTU蛋白；棉花黄萎病；纯化

棉花黄萎病是棉花作物的主要病害之一，广泛分布于世界各产棉国，是由棉花黄萎菌（Verticillium dahliae Kleb）的侵染而引起的棉花黄萎现象，容易导致整棵植株枯死萎蔫。自20世纪90年代以来，我国棉花黄萎病发生区域面积逐年增加，难以防治，对棉花生产产生了重大影响。目前，仅发现一种棉花黄萎菌病毒Verticillium dahliae chrysovirus 1（VdCV1）［1］，是以棉花黄萎菌为宿主的dsRNA病毒，全基因组包括4条dsRNA，其中一条dsRNA编码Ovarian Tumor Protease（OTU蛋白酶），功能不详。有关OTU蛋白酶基因的研究始于对果蝇等动物卵细胞发育方面的研究［2］，此后经序列比对发现，真核生物、细菌、病毒来源的含有OTU结构域的蛋白形成了一个大的超级科，有4个保守区［3］，有裂解泛素-蛋白结合物和去泛素化的功能［4-5］。研究dsRNA病毒的OTU蛋白是否具有去泛素化、降低真菌免疫力、增强病毒侵染能力的功能，对利用OTU基因及真菌病毒防治棉花黄萎病菌及其他病菌具有重要意义。

本研究表达、纯化了病毒VdCV1的OTU蛋白，为研究OTU蛋白功能提供了前提。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌Escherichia coli（E.coli）DH5α菌株、E.coli BL21菌株由本实验室保存，BP反应载体PDoner221、LR反应载体PET42-DEST（含有H is标签序列）购自Invitrogen公司，新西兰大白兔购自杭州师范大学动物实验中心，rTaq、M lu I酶、Pst I酶、DNA Marker、蛋白Marker购自Fementas公司，IPTG、PMSF、Imidazole、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，羊抗鼠IgG抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，Ni-NTA SweHarose、Ni柱亲和层析柱购自杭州艾路生物科技有限公司，引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建

以棉花黄萎菌病毒第4链VcR4的cDNA为模板，以P1∶5＇-GGGGAC AAGTTTGTACAAAAAAGCA GGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCGGCCTACAA GAGAGTGATG-3＇和P2∶5＇-GGGGACCACTTTGTAC AAGAAAGCTGGGTATGCCGGTCCTATCATCTGTTC-3＇为引物，用LA Taq聚合酶，PCR扩增OTU基因的ORF框。利用GateWay技术［6］，经过BP反应，将目的基因连入PDONR221（Kan+）载体；经过LR反应，将目的基因连至原核表达载体PET42-DEST（Amp+，含噬菌体T7启动子）上，酶切鉴定正确后送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.2.2 OTU蛋白的诱导表达及可溶性分析

将测序正确的重组表达质粒PET42-VcR4电转至E.coli BL21之中，筛选阳性克隆，按1∶100（V/V）接种于200 m L LB液体培养基（Amp+）中，37℃，225 r·min-1振荡培养至D600为0.6，加入IPTG至终浓度1 mmol·L-1，37℃诱导表达4 h，4℃，6 000 r·min-1，10 min离心收集菌体。然后加入200 m L PBS振荡重悬菌体，加入1 mol·L-1PMSF至终浓度为1 mmol·L-1，超声破碎菌液，12 000 g，10 min，分别取上清液和沉淀，沉淀再用200 m L PBS振荡重悬；涡旋上清液和沉淀，取出100μL加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀，100℃金属浴变性10 min；然后4℃超声破碎菌液，12 000 g，10 min，吸取上清液15 μL，SDS-PAGE电泳检测［7］。

1.2.3 包涵体的洗涤与溶解

取1 g包涵体，重悬于20 m L包涵体洗涤液Ⅰ（5 mmol·L-1EDTA，20 mmol·L-1Tris，1% Trion-X，PH 8.0），室温振荡10 m in，然后4℃，12 000 r·m in-1离心10 min，收集沉淀；加入10 m L包涵体洗涤液Ⅰ重悬，超声破碎，收集沉淀；加入20 m L包涵体洗涤液Ⅰ重悬。

收集沉淀，加入10 m L包涵体洗涤液Π（5 mmol·L-1EDTA，20 mmol·L-1Tris，4 mol·L-1尿素，0.3 mol·L-1NaCl，PH 8.0）室温振荡10 m in，然后4℃，12 000 r·min-1离心10 m in，收集沉淀；重复洗涤3次。

所得沉淀溶于10 m L溶解液（20 mmol·L-1Tris，8 mol·L-1尿素，0.3 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1β-巯基乙醇，PH 8.0），室温搅拌30 m in，至包涵体溶解，4℃，12 000 r·min-1离心10 min，收集变性蛋白上清液。

1.2.4 Ni柱亲和纯化重组蛋白

在玻璃层析柱中添加介质，确保填料均一无气泡无分层等现象，然后用5倍体积Lysis buffer平衡介质，取1倍柱床体积变性蛋白上清液低速上柱，孵育30 min。加入合适浓度的咪唑洗涤液洗涤，除去未结合及结合不牢固的杂蛋白，然后进行梯度浓度洗脱，分别收集洗脱液；SDS-PAGE电泳，确定最佳洗脱浓度；超滤浓缩，透析去离子，然后冷冻真空抽干，-20℃保存备用。

1.2.5 分子筛进一步纯化重组蛋白

将Ni柱亲和纯化的蛋白溶解于8 mol·L-1脲（20 mmol·L-1Tris，8 mol·L-1尿素，PH 8.0）中，利用AKTA Process系统匀速泵进分子筛平衡液（20 mmol·L-1Tris，8 mol·L-1尿素，PH 8.0）平衡，样品上样，匀速泵进分子筛洗脱液（0.3 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1Tris，8 mol· L-1尿素）洗脱，通过AKTA Process系统分析，分步收集不同峰段洗脱液；SDS-PAGE电泳，确定分离效果；超滤浓缩，透析去离子，冷冻真空抽干称重。采用Brad ford法定量检测纯化蛋白［8］。

1.2.6 Western blot鉴定

将经分子筛纯化的OTU蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后电转至硝酸纤维膜上；室温封闭液（0.5 g脱脂奶粉溶于8 m L TBST洗涤液中，混匀定容至10 m L）封闭2 h后，按1∶1 000向封闭液加入His标签抗体，孵育2 h，TBST洗涤液（TBS洗涤液中加入Tween-20至终浓度为0.05%）洗膜3次，每次10 m in；然后按1∶5 000向封闭液中加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，孵育2 h，TBST洗涤液充分洗膜；显色液显色，鉴定杂交结果。

2 结果与分析

2.1 表达载体pET42-V cR4构建结果

利用LR反应将目的基因连入PET-DEST42载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，摇菌提取质粒，经0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测，在8 281 bP位置出现一条特异性条带，与理论结果相符，说明成功构建原核表达载体PET42-VcR4。

PCR鉴定结果如图1所示，与预期大小一致（2 550 bP）；质粒经PstⅠ单酶切鉴定结果如图1所示，切出2个片段，与预期大小一致（4 936 bP和3 345 bP），其中1号泳道有3个条带，最大的片段为未酶切完全的质粒。

2.2 表达蛋白可溶性分析

重组菌BL21-PET42-VcR4、BL21-PET42-CmR（氯霉素蛋白）经4 h诱导表达，超声破碎后分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳来鉴定蛋白的可溶性。结果表明，氯霉素蛋白与OTU蛋白均以包涵体形式存在，属于不可溶性蛋白（图2）。

2.3 W estern b lot鉴定

为了进一步检测目的蛋白在大肠杆菌中是否表达，用H is标签抗体作为一抗，羊抗鼠HRP标签作为二抗进行Western blot检测。SDS-PAGE、Western blot结果如图3所示。结果表明，BL21-PET42-VcR4超声裂解后的沉淀出现特异性条带，其他均未出现条带，说明OTU蛋白在E.coli BL21中能正确诱导表达，并且以包涵体形式存在。

图1 入门载体PDOVCR4质粒酶切和PCR鉴定电泳图

图2 OTU蛋白与氯霉素蛋白的可溶性分析

2.4 N i-NTA柱亲和层析纯化结果

对含His标签的融合蛋白进行纯化，SDSPAGE电泳检测结果如图4所示。结果表明，纯化得到了条带较为单一、大小在97 ku左右的蛋白，说明目的蛋白纯化效果良好，而且目的蛋白最佳洗脱咪唑浓度为100 mmol·L-1。

2.5 分子筛纯化

将纯化蛋白进一步过分子筛纯化，通过AKETA分析仪，收集不同波段的紫外检测峰波蛋白溶液，分别进行SDS-PAGE电泳检测。分析波峰和电泳检测结果分别见图5和图6。

图3 OTU蛋白SDS电泳（A）和Western blot检测（B）

图4 OTU蛋白的纯化结果

由图5和6可知，0～8 min收集的样品，可能混有微量气泡，电泳没有条带；8～17 m in收集的样品，电泳显示有一条带，大小与目的蛋白一致，紫外检测波峰较好，但条带不清晰，表明目的蛋白的纯化效果较好，但浓度较低。

图5 分子筛纯化的OTU蛋白AKETA波段分析

3 小结与讨论

图6 分子筛纯化的OTU蛋白的SDS-PAGE分析

本研究采用Gateway克隆技术，成功构建棉花黄萎菌病毒VdCV1的OTU蛋白原核表达载体PET42-VcR4；使其在大肠杆菌中稳定表达。采用亲和层析与分子筛层析相结合的方法［9-10］，成功纯化OTU包涵体蛋白。病毒VdCV1的OTU蛋白的表达、纯化，是研究OTU蛋白的前期基础工作，对研究OTU蛋白酶的功能具有重要意义。

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（责任编辑：侯春晓）