BMP4通过诱导EMT促进肝癌迁移侵袭*

2015-11-23李霄孙保存邵兵赵秀兰张艳辉古强刘铁菊

中国肿瘤临床 2015年4期

李霄孙保存邵兵赵秀兰张艳辉古强刘铁菊

·基础研究·

李霄①②孙保存①②③邵兵①赵秀兰①②张艳辉③古强①②刘铁菊①②

目的：检测BMP4在肝癌中的表达并探讨BMP4在诱导肝癌EMT中的作用，进而研究其对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响。方法：采用免疫组织化学方法检测肝癌组织中BMP4的表达，分析其与肝癌临床病理资料之间的关系。将BMP4表达质粒转染至肝癌细胞系HepG2中，诱导BMP4外源性过表达。观察BMP4转染前、后HepG2的细胞形态学改变；Western blot检测转染前、后HepG2中BMP4、EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin）表达变化情况；划痕和侵袭实验检测BMP4对细胞迁移侵袭能力的影响。结果：BMP4与患者的年龄、病理分级、临床分期、不良预后密切相关。BMP4过表达后HepG2呈现典型的EMT形态学改变，E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调、细胞的迁移侵袭能力显著增强。结论：BMP4与肝癌临床病理资料密切相关，并可能通过诱导EMT促进肝癌细胞的迁移侵袭能力。

肝细胞癌 BMP4 上皮间质转化迁移侵袭

1Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070;2Department of Pathology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052;3Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,Tianjin 300060,China

This work was supported by the Key Project of the National Natural Science Foundation of China(No.81230050),the National

Natural Science Foundation of China(No.81172046 and 81173091),and the Key Project of the Tianjin Natural Science Foundation(No.12JCZDJC23600)

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国高发、危害极大的恶性肿瘤，其发病隐匿，侵袭性生长快速，并且手术切除率很低，术后5年内复发率高达50%～70%。造成这种结局的主要原因是

HCC的高侵袭性和肝内和（或）肝外转移［1-4］。因此，研究HCC迁移侵袭的发生机制对改善肝癌患者预后，延长患者生存期具有重要的意义。研究发现，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在HCC的迁移侵袭过程中起到关键性的作用［5］。因此，研究肝癌EMT的发生将有助于揭示肝癌迁移侵袭的调控机制，并可能为寻找肝癌治疗靶点提供理论基础。BMP4作为TGF-β超家族中的一员［6］，在肿瘤的演变过程中发挥着重要作用［7-11］。但BMP4是否通过诱导EMT促进肝癌迁移侵袭的探讨尚少。因此本研究首先采用免疫组织化学法检测肝癌组织中BMP4的表达情况，并探讨BMP4与肝癌临床病理资料的相关性。其次将BMP4表达质粒转染入HepG2细胞中，观察BMP4过表达的HepG2细胞的形态学变化以及E-cadherin、Vimentin表达的变化，并观察BMP4对HepG2细胞迁移侵袭能力的影响，探讨BMP4是否能通过诱导EMT的发生从而促肝癌的迁移侵袭能力。本研究旨在为肝癌的诊断、治疗提供新的思路和有效途径。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1组织标本选取天津医科大学肿瘤医院和天津医科大学总医院2001年2月至2005年11月经手术切除并病理诊断为原发性肝细胞肝癌并且随访资料完整的患者标本92例。

1.1.2细胞株人肝癌细胞株HepG2为天津医科大学病理学实验室自存。

1.1.3实验试剂DMEM购自美国Neuronbc公司，胎牛血清购自中国Thermo公司。载体为pEZ-M98的BMP4表达质粒购自GeneCopoeia，Inc.（catalog no. EX-A0242-M98）。细胞转染试剂聚乙酰亚胺（percutaneous ethanol injection，PEI）购自美国Polyscience公司。Transwell小室购自美国FALCON公司。兔抗人单克隆抗体BMP4、鼠抗人单克隆抗体E-cadherin、兔抗人多克隆抗体Vimentin均购自美国Abcam公司。兔抗人多克隆抗体GAPDH、PV6000通用二步法免疫组化试剂盒、山羊抗兔IgG抗体、山羊抗鼠IgG抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色HCC组织石蜡包块4 μm连续切片常规脱蜡水化；3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶；微波热修复；正常血清室温封闭，一抗4℃过夜，次日二抗孵育，DAB显色，苏木素复染细胞核，封片。PBS代替一抗作为阴性对照。染色结果判断标准：阳性细胞百分率为每例标本选择10个代表性的高倍（×400）视野分别计数100个肿瘤细胞，取平均值为阳性细胞百分率。规定0%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，＞50%为3分。染色强度：阴性为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分。染色指数为阳性细胞百分率与染色强度的乘积。染色指数≥4分为BMP4免疫组织化学染色阳性（+），＜4分为阴性（-）。

1.2.2细胞系和培养条件人肝癌细胞系HepG2按常规培养模式进行培养：培养基为Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）。培养条件为37℃，5%CO2恒湿环境。

1.2.3细胞转染细胞培养至70%～80%汇合时转染，转染前更换为无血清、无抗生素的新鲜培养液。以1:2比例混匀质粒和转染试剂（PEI），静置10 min后加入培养基中，6 h后更换为条件培养液。转染48 h后进行转染效果评价。

1.2.4细胞形态检测在细胞培养状态下，将稳转BMP4后的HepG2细胞置于倒置显微镜下观察转染前后EMT形态的改变。

1.2.5Western blot法检测用细胞裂解液RIPA-SDS裂解细胞，提取其总蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳。PVDF膜转膜1.5 h，5%脱脂奶粉封闭室温1 h，加入一抗，4℃孵育过夜，次日恢复室温后与相应二抗2 h，TBST漂洗，加入发光液显影、定影、照相。

1.2.6细胞划痕实验将细胞接种于6孔板，用100 μL Tip头对其表面进行划痕，PBS洗掉游离细胞后，加入培养基，此时记为0 h，随机取5个视野，在倒置显微镜下观察细胞从划痕向中央迁移的情况，分别于0、24、48、72 h拍照测量划痕距离，并计算迁移率。

1.2.7细胞侵袭实验将Transwell小室包被Matirge胶并在培养箱中过夜，次日消化细胞并用无血清的DMEM培养液重悬，将细胞悬液接种于上室，下室用常规培养基，培养48 h后取出Transwell小室，甲醇固定，结晶紫染色，分析穿透能力。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件包进行分析，计量资料采用t检验。计数资料采用χ2检验。采用Kaplan-Meier方法进行生存分析，生存率比较采用Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1BMP4的表达及与HCC患者临床病理资料的关系

免疫组织化学染色结果显示，BMP4阳性表达产物呈棕黄色，主要定位于肝癌细胞浆（图1）。在92例肝癌标本中，BMP4阳性表达56.52%（52/92）。分析BMP4的表达与HCC患者临床病理资料的关系显示，BMP4在年龄＞45岁的患者中表达较高，而在≤45岁

的患者中表达较低，差异有统计学意义（χ2=8.400，P= 0.004）。BMP4在不同病理分级的患者中表达不同，BMP4在低分化（Ⅲ～Ⅳ级）的患者中表达高于高分化（Ⅰ～Ⅱ级）的患者，差异具有统计学意义（χ2= 4.048，P=0.044）。BMP4在不同临床分期的患者中表达也不同，在Ⅲ～Ⅳ期患者中的表达较Ⅰ～Ⅱ期的患者表达高，差异有统计学意义（χ2=5.475，P=0.019）。BMP4在不同性别、肿瘤大小、有无转移患者中的差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。生存分析结果显示，BMP4阳性组较BMP4阴性组的生存时间短，差异有统计学意义（P=0.04，图2）。

图1 BMP4在肝癌组织中定位于细胞浆的阳性表达及BMP4在肝癌组织中的阴性表达（IHC×400）Figure 1Representative BMP4-positive HCC samples with staining mainly in the cytoplasm and BMP4-negative HCC samples showing almost no appreciable staining（IHC×400）

表1 BMP4与肝癌临床病理资料的关系Table 1Correlation between BMP4 and clinicopathologic data of HCC patients

图2 BMP4（+）患者较BMP4（-）患者的生存时间短Figure 2Kaplan-Meier survival analysis showed that BMP4-positive patients had shorter survival periods than BMP4-negative patients

2.2HepG2细胞转染BMP4后细胞形态的变化

HepG2细胞转染BMP4表达质粒，构建HepG2-BMP4上调模型后，在倒置显微镜下观察发现，HepG2-BMP4细胞与未转染细胞（HepG2）相比，其形态发生了明显改变，细胞由排列紧密如铺路石样的结构转变为成纤维细胞样，呈现典型的EMT形态学改变（图3）。

2.3HepG2细胞转染BMP4后BMP4、E-cadherin、Vimentin的表达变化

利用Western blot检测转染前、后HepG2细胞BMP4、E-cadherin、Vimentin的表达变化情况，结果显示，转染BMP4后，HepG2细胞BMP4表达明显增高，提示转染成功。过表达BMP4后可以使HepG2细胞E-cadherin的表达下调，Vimentin的表达上调（图4）。结果说明BMP4能够通过调控上皮表型（E-cadherin）和间质表型（Vimentin）的表达参与EMT。

2.4HepG2细胞转染BMP4后细胞迁移能力的变化

采用细胞划痕实验评价转染BMP4后HepG2细胞迁移、运动能力的变化情况。实验结果表明，HepG2细胞过表达BMP4后，与未转染组相比，在24、48、72 h时间点，其细胞迁移能力显著增强，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5）。结果表明，BMP4可以促进HepG2细胞的迁移和运动。

2.5HepG2细胞转染BMP4后细胞侵袭能力的变化

采用细胞侵袭实验评价转染BMP4后HepG2细胞侵袭能力的变化情况。结果表明，转染BMP4后，细胞穿透滤膜至小室背面的细胞数显著高于未转染预组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图6）。结果表明，BMP4可以促使细胞侵袭能力明显增强。

图3 BMP4转染后HepG2细胞结构改变（×100）Figure 3After BMP4 transfection，the morphology of HepG2 cells showed significant changes from a paving stone structure with cell-cell adhesion（right）to a fibroblastic shape（left），which showed typical EMT change（×100）

图4 Western blot检测BMP4转染前、后HepG2细胞中BMP4、EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin）的表达变化Figure 4Changes of BMP4 and EMT-related protein（E-cadherin and Vimentin）expression in HepG2 cells were detected by Western blot after BMP4 transfection

▶A.Wound healing assay（×40）；B.Statistics of analysis of migration rate datainHepG2-BMP4 cells and HepG2 cells at 24，48，and 72 h（P＜0.05）图5过表达BMP4对HepG2细胞迁移能力的影响Figure 5Effects of BMP4 on the migration capacity of HepG2 cells

图6 过表达BMP4对HepG2细胞侵袭能力的影响Figure 6Effects of BMP4 on the invasion capacity of HepG2 cells

3 讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，根治性切除机会极少，术后复发率极高，迁移和侵袭是肝癌复发的主要因素。肿瘤迁移侵袭涉及多种调控机制，其中重要机制之一就是上皮间质转化（EMT）。EMT是指上皮细胞在特定的情况下向间质细胞转化的现象，其主要特征为上皮表型的丧失及间质表型（vimentin）的获得。越来越多的证据表明EMT在肝癌细胞的播散过程中发挥着极其重要的作用［12-15］。EMT的发生受许多细胞因子及微环境的调控，其中TGF-β是调控生长和分化的相关多肽因子家族之一。TGF-β家族成员可以在许多病理情况下启动和维持EMT，尤其是通过重要信号通路的激活［16］。TGF-β通路是目前公认的作用比较明确的诱导EMT的信号通路［17］。

BMP4作为TGF-β超家族的一员，其生物学功能相当广泛，包括促进骨和软骨的生成，调控多种细胞的增殖和分化，并在多种脏器的生长发育中发挥重要作用［18］。BMP4主要通过经典通路发挥其作用，即BMP4在与相应的细胞受体结合后，其生物信号主要通过TGF-β/Smads分子通路进行传导，进而调控相关转录因子最终对机体进行功能调节［19］。近年来有研究发现BMP4可诱导某些上皮细胞源性肿瘤细胞发生EMT从而促进其迁移侵袭，如在乳腺癌和胰腺癌中，BMP4可以通过经典通路诱导EMT的发生进而促进肿瘤细胞的迁移侵袭能力［20-21］。但BMP4在肝癌中是否可以通过诱导EMT从而促进迁移侵袭尚不清

楚。本实验主要研究BMP4在诱导肝癌EMT发生中的作用，进一步明确其在肝癌迁移侵袭中的重要作用。在前期研究中用免疫组织化学方法检测肝癌组织中BMP4的表达发现，BMP4在肝癌患者中呈较高表达，并与患者的年龄、病理分级、临床分期、不良预后密切相关，提示BMP4可能与肝癌的高迁移侵袭能力有关。在此基础上，本研究将BMP4转染入肝癌细胞HepG2中，诱导外源性BMP4过表达。经形态学检测，过表达BMP4后的HepG2细胞的形态发生了明显变化，呈典型的EMT形态学改变，并且与未转染BMP4的HepG2细胞相比，HepG2-BMP4细胞中上皮标志物E-cadherin表达明显降低，间质标记物Vimentin表达明显升高，这说明BMP4可以诱导HepG2细胞EMT的发生，同时HepG2细胞在体外的迁移侵袭能力也显著增强，说明在体外BMP4能够促进肝癌细胞的迁移侵袭，这与本实验的前期研究结果相吻合。

综合以上研究结果，本研究认为BMP4可以通过诱导肝癌细胞发生EMT促进肝癌的迁移侵袭，这可能为肝癌的诊断、治疗提供新的思路和有效途径。但是BMP4在肝癌中促进肿瘤迁移侵袭的内在机制很复杂，诱导EMT可能只是其中的某一个环节，因此BMP4在肝癌细胞迁移侵袭过程中的其他作用机制，还需要进一步探讨。

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（2014-09-10收稿）

（2014-10-25修回）

（编辑：周晓颖）

BMP4 promotes migration and invasion of hepatocellular carcinoma by inducing epithelial-mesenchymal transition

Xiao LI1,2,Baocun SUN1,2,3,Bing SHAO1,Xiulan ZHAO1,2,Yanhui ZHANG3,Qiang GU1,2,Tieju LIU1,2

Baocun SUN;E-mail:Sunbaocun@aliyun.com

Objective:To determine the expression of BMP4 in hepatocellular carcinoma(HCC)and to study the role of BMP4 in inducing epithelial-mesenchymal transition(EMT)to analyze the effect of BMP4 on the migration and invasion of HCC cells. Methods:The expression of BMP4 in HCC specimens was examined by immunohistochemistry staining,and the correlations were analyzed between the expression of BMP4 and clinicopathological data.The BMP4 expression plasmid was transfected into HepG2 cells to induce exogenous overexpression of BMP4 protein.The changes of HepG2 cell morphology were detected after BMP4 transfection by using a microscope;the changes of the expression of BMP4,EMT-related protein(E-cadherin,Vimentin)in HepG2 cells were detected by Western blot after transfection of BMP4;the wound healing assay in vitro was used to detect the effects of BMP4 gene transfection on the ability of migration of HepG2 cells;the invasion assay was used to determine the role of transfection of BMP4 on the invasive potential of HepG2 cells.Results:Immunohistochemistry staining method displayed that BMP4 expression was positively associated with age,histological differentiation,stage,and poor prognosis.After BMP4 overexpression,the morphology of HepG2 cells showed significant changes from a paving stone structure with cell-cell adhesion to a fibroblastic shape,which showed typical EMT change;Western blot exhibited that the expression of E-cadherin was downregulated and the Vimentin expression was upregulated in HepG2 cells;the wound healing and invasion assay showed that the migration and invasion potentials of HepG2 cells were significantly enhanced.Conclusion:BMP4,which displayed a high expression in HCC specimens,was closely associated with clinicopathologic data,and BMP4 may promote migration and invasion of HCC cells by inducing epithelial-mesenchymal transition.

hepatocellular carcinoma(HCC),BMP4,epithelial-mesenchymal transition(EMT),migration,invasion