p53基因codon 72多态性与乳腺癌术后放化疗疗效相关性分析

2015-11-23铁剑解云涛徐晔朱广迎

中国肿瘤临床 2015年3期

铁剑解云涛徐晔朱广迎

·临床研究与应用·

铁剑①解云涛②徐晔②朱广迎①

目的：分析p53基因codon 72多态性与乳腺癌患者术后放化疗的预后相关性。方法：选取北京大学肿瘤医院乳腺癌患者术后接受放化疗427例，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法分析其p53基因codon 72多态性，比较不同基因型患者间复发及生存的差异。结果：全部患者基因型分布为Pro/Pro型18.3%（78/427）、Pro/Arg型44.0%（188/427）、Arg/ Arg型37.7%（161/427）。3种基因型间无局部复发生存（LRFS）、无局部区域复发生存（LRRFS）、无远处转移生存（DDFS）及总生存（OS）均无显著性差异（均P＞0.05）。427例患者中雌激素受体（ER）阳性为303例，其中Arg/Arg基因型患者OS明显优于Pro/Pro基因型患者（χ2=6.330，P=0.042）。在多因素分析中p53基因codon 72多态性是ER阳性患者LRFS、LRRFS、DDFS及OS的独立预后因素，Pro/Pro基因型的患者较Arg/Arg基因型的局部复发风险增加5.9倍（HR=5.9，95%CI 1.1～31.1，P=0.036），局部区域复发风险增加3.1倍（HR=3.1，95%CI 1.1～9.1，P=0.039），远处转移风险增加2.8倍（HR=2.8，95%CI 1.3～6.0，P=0.010），死亡风险增加4倍（HR=4.0，95%CI 1.3～12.0，P=0.013）。结论：在ER阳性的乳腺癌术后接受放化疗患者中，Pro/Pro基因型的局部及局部区域复发风险、远处转移风险、死亡风险均高于Arg/Arg基因型。

乳腺癌放射治疗化疗 p53基因 codon 72多态性

现已发现p53基因多态性至少为10种，而位于第4外显子的72密码子（codon 72）多态性因与多种肿瘤的易感性相关而备受关注［1-3］。p53基因codon 72具有CGC或CCC两种单核苷酸多态性，可以表达产生两种不同的野生型p53蛋白，即含精氨酸残基的p53蛋白（Arg p53）或含脯氨酸残基的p53蛋白（Pro p53），从而产生Arg/Arg纯合型、Pro/Pro纯合型与Pro/ Arg杂合型3种不同的基因型。研究显示，两种p53蛋白具有不同的生化和凋亡能力，在野生型p53中，Arg p53较Pro p53有更强的诱导凋亡能力［4］。乳腺癌患者的研究发现，codon 72多态性造成患者对化疗以及内分泌治疗反应的不同［5-6］，甚至影响到患者的生存［7］。本研究通过回顾性分析乳腺癌术后接受放化疗患者，探究p53基因codon 72多态性对乳腺癌患者术后接受放化疗的疗效及其生存的影响。

1 材料与方法

1.1临床资料

选取北京大学肿瘤医院2003年7月至2007年12月经病理证实为浸润性乳腺癌的患者427例，患者术后、化疗后接受了放疗，并均在确诊时进行了p53基因codon 72基因型的检测。患者年龄23～81岁，中位年龄46岁，雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性患者为303例，孕激素受体（progesterone receptor，PR）阳性患者为260例，人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）阳性患者为112例。患者行保乳手术为300例，改良根治术为127例。淋巴结转移均经病理证实。依据UICC分期，Ⅰ期为26例（6.1%），Ⅱ期为324例（75.9%），Ⅲ期为77例（18.0%）。所有患者均接受了化疗，激素受体阳性的患者接受了辅助内分泌治疗。保乳术后的放疗的患者在全乳照射后均行瘤床加量，部分接受了锁骨上下区照射；改良根治术后的放疗患者接受了胸壁及锁骨上下区照射。中位随访时间83.2（3～116）个月。

1.2DNA提取及p53基因codon 72的基因型检测

采用酚氯仿从患者血液标本的淋巴细胞中萃取DNA，p53基因codon 72的基因型通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术确定。使用的正向引物为5'-TCCCCCTTGCCGTCCCAA-3'，反向引物为5'-CGTGCAAGTCACAGACTT-3'。PCR在总体积为20μL的反应混合物中完成，包括100 ng DNA，2 μL 10×PCR缓冲剂，0.8 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP），2.5 mmol/L氯化镁（MgCl2），0.5 μmol/L的引物，1个单位的AmpliTaq DNA聚合酶。反应条件为94℃预变性2 min、94℃变性0.5 min、60℃退火0.75 min、72℃延伸0.5 min，35个循环后，延伸10 min。取PCR产物10 μL与美国New England Biolabs公司生产的BstU1限制性核酸内切酶60℃水浴2 h，产物使用2.5%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。Pro/Pro基因型显示1条带，Arg/Arg显示2条带，杂合子Arg/Pro显示3条带（图1）。

图1 PCR-RFLP法测定p53基因codon 72的基因型Figure 1Detection of the codon 72 genotype using PCR-RFLP

1.3统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。基因型与患者临床病理特点的相关性分析采用计数资料的Pearson's χ2检验。采用Kaplan-Meier生存分析方法评估患者生存，各基因型间生存差异采用Log Rank检验。影响生存的多因素分析采用Cox回归模型，应用进入法对各因素进行检验。进行双侧统计检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1乳腺癌患者p53基因codon 72的基因型分布

427例患者中基因型分布为Pro/Pro型18.3%（78/ 427）、Pro/Arg型44.0%（188/427）、Arg/Arg型37.7%（161/427）。p53基因codon 72的基因型分布与患者年龄、临床分期、淋巴结转移、ER或PR以及HER-2状态均无明显相关性（表1）。

2.2p53基因codon 72的基因型与生存的关系

全部患者的5年无局部复发生存（local recurrence free survival，LRFS）为94.4%（95%CI 0.922～0.966），5年无局部区域复发生存（local regional recurrence free survival，LRRFS）为92.9%（95%CI 0.904～0.954），5年无远处转移生存（distant disease free survival，DDFS）为86.0%（95%CI 0.827～0.893），5年总生存（overall survival，OS）为92.6%（95%CI 0.901～0.951）。codon 72不同基因型患者LRFS、LRRFS、DDFS及OS间差异无统计学意义（P＞0.05，表2，图2）。

根据患者ER及HER-2表达进行亚组分析后发现，HER-2阴性或阳性，以及ER阴性患者预后在p53基因codon 72不同基因型间无显著性差异。但在ER阳性的303例患者中，Arg/Arg基因型患者OS明显优于Pro/Pro基因型患者（P＜0.05，表3，图3）。

表1427 例患者p53基因codon 72的基因型与临床病理学特征的关系Table 1Correlation between p53 codon 72 genotypes and patients'clinicopathologic characteristics in 427 patients

表2427 例患者p53基因codon 72的基因型与生存的关系Table 2Correlation between p53 codon 72 genotypes and survival rate in 427 patients

图2427 例患者不同p53基因codon 72基因型间生存比较Figure 2Comparison of the survival rates among 427patients with different p53 codon 72 genotypes

表3303 例ER阳性患者p53基因codon 72基因型与生存的关系Table 3Correlation between p53 codon 72 genotypes and ER-positive 303 patients'survival

图3303 例ER阳性患者不同p53基因codon 72基因型间生存比较Figure 3Comparison of the survival rates among 303 ER-positive patients with different p53 codon 72 genotypes

在全部患者的多因素分析中，p53基因codon 72的基因型不是LRFS、LRRFS、DDFS以及OS的独立预后因素。但在ER阳性的303例患者中，采用进入法校正年龄、HER-2状态、临床分期和基因型后发现，p53基因codon 72的基因型是LRFS、LRRFS、DDFS以及OS的独立预后因素。Pro/Pro基因型患者局部复发风险、局部区域复发风险、远处转移风险及死亡风险均明显高于Arg/Arg型患者（表4）。为排除p53基因codon 72多态性与ER状态间存在相互影响，在全部患者多因素分析中加入了两者的交互项，结果并未发现其与预后相关。

表4 ER阳性患者生存的多因素分析Table 4Multivariate analysis of ER-positive patients

3 讨论

本课题组前期研究发现，Arg/Pro及Arg/Arg基因型乳腺癌患者对化疗更加敏感［5］。在此基础上，本研究对427例乳腺癌术后接受化疗患者进行了p53基因codon 72多态性与术后放疗疗效的研究，而研究结果并未发现p53基因codon72不同基因型与放化疗后的局部复发以及局部区域复发间有明显的相关性。

p53基因codon72多态性对癌症患者生存的影响目前还存在争议。以往的研究显示，具有Pro/Pro基因型的乳腺癌患者生存较其他基因型患者差［7］。在头颈部肿瘤及神经母细胞瘤患者中也发现了同样的结果［4，8］。但另外的研究中却发现，具有Arg等位基因的乳腺癌患者对治疗的反应及预后较差［9］，而Pro/Pro基因型的鼻咽癌患者表现出较好的无进展生存［10］。本研究中，全部患者p53基因codon 72的3种不同基因型间并未显示出生存的明显差异，这与近期的另外几项乳腺癌研究结果相似［11-12］。这种研究结果的

差异，可能源于p53状态的不同。在野生型p53中，Arg等位基因有更强的诱导凋亡能力，具有Arg等位基因患者的OS和无进展生存（progress free survival，PFS）优于含Pro等位基因的患者［4］。而在突变型p53中，结果恰恰相反，Pro等位基因较Arg等位基因有更强的诱导凋亡能力，具有Pro等位基因患者的OS及PFS优于含Arg等位基因的患者［13］。

Desmedt等［14］的研究显示，乳腺癌p53突变率约为30%，而ER阳性患者的p53突变率仅26%［15］。较低的p53突变率可能是本研究ER阳性的患者Arg/ Arg基因型预后明显优于Pro/Pro基因型的原因。

总之，本研究发现在乳腺癌患者接受放化疗的ER阳性患者中，Arg/Arg基因型的预后明显优于Pro/ Pro基因型，但这一结论还需要更大样本及更加完善的研究加以证实。

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（2014-10-13收稿）

（2015-01-23修回）

Association between p53 codon 72 polymorphism and curative effect of postoperative chemo-radiotherapy for breast cancer

Jian TIE1,Yuntao XIE2,Ye XU2,Guangying ZHU1

Guangying ZHU;E-mail:zgypu@aliyun.com

Objective:To investigate the association between p53 codon 72 polymorphism and the prognosis of breast cancer patients receiving chemotherapy and radiotherapy after surgery.Methods:A total of 427 breast cancer patients treated with chemo-radiotherapy after surgery at Beijing Cancer Hospital were selected for this study.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism was adopted to analyze the p53 codon 72 polymorphism.Survival analysis was conducted to compare the disparities of recurrence and survival among the patients with different p53 codon 72 polymorphic variants.Results:The distribution of three genotypes of p53 codon 72 in our cohort is as follows:Pro/Pro 18.3%(78/427),Pro/Arg 44.0%(188/427),and Arg/Arg 37.7%(161/427). No significant difference was observed among the local recurrence-free survival(LRFS),loco-regional recurrence-free survival(LRRFS),distant disease-free survival(DDFS),and overall survival(OS)among the three genotypes(all P>0.05).Among the 303 estrogen receptor(ER)-positive patients,OS was significantly better in patients with Arg/Arg genotype than those with Pro/Pro genotype(χ2= 6.33,P=0.042).The multivariate analysis showed that the p53 codon 72 polymorphism is an independent factor of prognosis for LRFS, LRRFS,DDFS,and OS of ER-positive patients.For the ER positive patients with Pro/Pro genotype,the local recurrence,local-regional recurrence,distant metastasis,and mortality risks were 5.9(HR=5.9,95%CI 1.1-31.1,P=0.036),3.1(HR=3.1,95%CI 1.1-9.1,P= 0.039),2.8(HR=2.8,95%CI 1.3-6.0,P=0.010),and 4.0(HR=4.0,95%CI 1.3-12.0,P=0.013)times higher than those with Arg/Arg genotype,respectively.Conclusion:For ER-positive breast cancer patients who underwent surgery and chemo-radiotherapy,the local recurrence,loco-regional recurrence,distant metastasis,and mortality risk with Pro/Pro genotype are significantly higher compared to those withArg/Arg genotype.

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