三个原发位点突变的Leber遗传性视神经病变中医证候及临床特点分析

解世朋 王 浩 常永业 石慧君 张铭连

三个原发位点突变的Leber遗传性视神经病变中医证候及临床特点分析

解世朋 王 浩 常永业 石慧君 张铭连

目的探讨临床最常见的3个原发致病基因突变导致的Leber遗传性视神经病变患者的中医证候特点和辨证规律。方法回顾分析2001年12月至2013年12月在河北省眼科医院（原邢台市眼科医院）就诊具有ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A线粒体DNA突变阳性的219例Leber遗传性视神经病变先患者的中医证候特点和辨证分型，分析各证型与3个原发基因突变的关系，总结Leber遗传性视神经病变的中医证候特点和辨证规律。结果219例患者中ND4 G11778A突变188例，ND6 T14484C突变23例，ND1 G3460A突变8例。中医辨证为肝经郁热107例，其中ND4 G11778A突变92例，ND6 T14484C突变10例，ND1 G3460A突变5例；肝郁阴虚45例，其中ND4 G11778A突变38例，ND6 T14484C突变6例，ND1 G3460A突变1例；肝肾阴虚67例，其中ND4 G11778A突变58例，ND6 T14484C突变7例，ND1 G3460A突变2例。结论具有3个原发基因突变的Leber遗传性视神经病变患者发病与肝肾联系最为密切，早期以实证为主，多表现为肝经郁热；中期虚实夹杂，多表现为肝郁阴虚；晚期以虚证为主，多表现为肝肾阴虚。

Leber遗传性视神经病变；中医证候；线粒体；基因突变

Leber遗传性视神经病变（Leber′s hereditary optic neuropathy，LHON）是眼科常见的一种线粒体DNA突变导致视网膜神经节细胞退行性病变的母系遗传性疾病。1871年，德国眼科医生Leber首先报道了该病的临床特征〔1〕，1988年Wallace等〔2〕首次发现该病与线粒体DNA（mitochondrial，mtDNA）MT-ND4基因的11778G＞A突变有关，到目前为止，已经报道的与LHON发病有关的mtDNA有60多个［http：//www. mitomap.org］，而90%～95%的患者只携带该病3个mtDNA原发突变（即3460G＞A、11778G＞A或14484T＞C）中的一个。近年来，本病分子遗传学方面的研究取得较大进展，但在治疗方法及药物方面并没有大的突破，因此，探讨分析LHON患者的中医证候特点，总结其辨证规律，对指导中医药干预治疗有一定的临床意义。我们回顾性研究了在河北省眼科医院（原邢台市眼科医院）就诊具有ND4G11778A、ND6T14484C、ND1 G3460A线粒体DNA突变阳性的Leber遗传性视神经病变先证者，总结了其中医证候特点及辨证分型规律。

1 资料和方法

1.1 病例资料及入选标准

对2001年12月至2013年12月就诊于邢台市眼科医院符合以下入选标准的LHON患者进行研究。病例入选标准：①mtDNA检测ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A至少一个位点突变阳性；②进行视野、视觉电生理、FFA等检查排除合并Best病、stargardt病、青光眼等引起视功能受损的其它眼病；③行头颅CT或MRI排除颅内疾患。

1.2 研究方法

对符合病例入选标准具有ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A位点突变的LHON患者进行病历回顾，总结分析其病史、中医问诊、望诊和切诊情况、辨证分型、视力、眼底、视觉电生理、荧光素眼底血管造影、自动静态视野等检查结果，总结其中医辨证分型、发病诱因、伴随症状及临床特点。

1.3 基因检测方法

所有病例均委托浙江大学进行mtDNA检测。抽取患者外周静脉血2 ml，采用滤纸片法邮寄至浙江大学生命科学院。取1 cm2的滤纸片放到1.5 ml的离心管中，加入灭菌的DNA提取缓冲液500 μl至离心管中，然后再加入30 μl新鲜配制的蛋白酶K溶液，混匀，置于37℃水浴箱过夜。放入乙二胺四乙酸抗凝管中，采用酚-氯仿抽提法提取外周血白细胞DNA。应用Primer 3软件设计mtDNA目的片段引物，聚合酶链式反应（PCR）扩增片段。引物序列为17F（5'-TCACTCTCACTGCCCAAGAA-3'）、17R（5'-GGAGAATGGGGGATAGGTGT-3'）、21F（5'-GCATAATTAAACTTTACTTC-3'）。PCR反应体系为50 μl： 25 μl Taq Mix，上下游物各1 μl、基因组DNA80 ng，加去离子水至50 μl。PCR反应条件：95℃预变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复循环36次，最后72℃延伸10 min。采用15 g/L琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带，切胶回收，过柱纯化后由上海快基生物科技有限公司进行测序反应并进行测序结果分析。

2 结果

2.1 基因分布与发病年龄

219例入选患者中，ND4 G11778A突变188例，男性124例，女性64例，年龄最小6岁，最大45岁，平均（18.32±6.25）岁；ND6 T14484C突变23例，男性16例，女性7例，年龄最小7岁，最大36岁，平均（16.32±4.25）岁，ND1 G3460A突变8例，男性6例，女性2例，年龄最小7岁，最大26岁，平均（16.13± 6.4）岁。发病至就诊时间最短为2天，最长为183天，平均（20.27±23.71）天。

2.2 中医证候结果

（1）肝经郁热证107例，其中ND4 G11778A突变92例，ND6 T14484C突变10例，ND1 G3460A突变5例，该型证候特点为发病1～2个月，发病前有紧张、劳累、剧烈运动等诱因或无诱因，眼部表现为患眼视物模糊，视盘色红，鼻侧较重，盘周视网膜血管扩张，中心凹光反射不见，伴情志抑郁、胸闷易怒，舌质红，苔薄白，脉弦细。（2）肝郁阴虚45例，其中ND4 G11778A突变38例，ND6 T14484C突变6例，ND1 G3460A突变1例，证候特点为发病时间超过3个月，眼部表现为患眼视物模糊，视盘鼻侧色红，颞侧色淡，乳斑间神经纤维变薄，色泽发暗，视网膜血管走形大致正常，中心凹光反射不见，舌质红，苔薄白，脉弦细，或伴腰膝酸软，精神抑郁等。（3）肝肾阴虚67例，其中ND4G11778A突变58例，ND6T14484C突变7例，ND1 G3460A突变2例，证候特点为发病时间超过6个月，眼部表现为患眼视物模糊，视盘淡或色苍白，乳斑间神经纤维变薄，色泽发暗，视网膜动脉变细，中心凹光反射不见，舌质红，苔少，脉细数，或伴五心烦热、潮热盗汗、遗精等。

2.3 致病诱因及职业分析

头面部外伤3例；感冒或其他原因发热11例；剧烈运动4例；学习紧张13例；劳累（农忙、军事训练等）8例；口服抗结核药物治疗1例，无明显诱因179例；职业分布：学龄前儿童11例，小学生73例，初中生44例，高中生15例，大学生9例，农民39例，工人12例，司机6例，军人4人，公务员6人。

2.4 中医证候、基因位点、性别与平均视力（logMAR）关系

肝郁阴虚型G11778A男性患者logMAR视力最差（一般线性模型方差分析，F=4.15，P=0.017）；6个月后各组患者平均视力均优于发病时视力（配对t检验，t=94.59，P=0.001），其中G11778A男性患者平均视力最差（一般线性模型方差分析，F=6.624，P= 0.011，表1）。

3 讨论

Leber遗传性视神经病变近年报道了很多与之发病相关的位点，但是临床上最多见的仍然是ND4 G11778A、ND6 T14484C、ND1 G3460A三个原发突变位点。虽然LHON为母系遗传性疾病，但是表现为不完全外显，存在明显的性别差异，不同位点突变的患者，甚至是同一家族中不同的患者最终视功能存在很大差异。LHON发病为线粒体DNA突变所致，而线粒体为细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞活动提供能量，有“细胞动力工厂”之称，我们在调查患者的发病诱因时发现部分患者在出现头面部外伤、发热、剧烈运动或精神紧张、劳累等人体应激反应后发病，考虑可能在这种条件下细胞的能量消耗增加，刺激线粒体合成更多的ATP，加重线粒体负荷，使本身存在缺陷的细胞不堪重负，而出现功能障碍，从而导致视功能受损。有报道LHON有自我恢复现象，11778，3460，14484不同突变位点患者，最终视力自行恢复率分别是4%，22%及37%〔3，4〕，但是目前现代医学对LHON的治疗策略仍然有限，大多认为短链醌类化合物（如艾地苯醌），在疾病的早期阶段对LHON患者的视力有保护作用，另外基因治疗虽然是一种很好的方法，但是仍然处于试验阶段〔5，6〕。中医也对LHON做了较多的研究，周剑认为LHON的发病与中医体质有密切的联系〔7〕，而孙艳红的研究结果证明LHON组及发病组中平和质的比例均降低，阴虚质和气郁质比例均增高〔8，9〕，张铭连〔10，11〕曾先后对66例及81例LHON患者进行中医辨证及治疗，认为LHON患者发病与中医肝肾关系最为密切，早期多表现为肝经郁热、晚期多表现为肝郁阴虚或肝肾阴虚型，应用中医辨证治疗后部分患者的视力得到提高。本研究旨在发现不同的中医证候与LHON发病之间的联系，从而指导中医辨证治疗。本组研究发现Leber发病，早期多以实证为主，表现为肝经郁热，眼底表现为视盘色红，鼻侧较重，盘周视网膜血管扩张，中心凹光反射不见，全身伴情志抑郁、胸闷易怒等；中期发展为虚实夹杂，表现为肝郁阴虚，眼底表现为视盘鼻侧色红，颞侧色淡，乳斑间神经纤维变薄，色泽发暗，中心凹光反射不见，全身伴腰膝酸软，精神抑郁等；晚期多以虚证为主，表现为肝肾阴虚，眼底表现为视盘淡或色苍白，乳斑间神经纤维变薄，色泽发暗，视网膜动脉变细，中心凹光反射不见，舌质红，苔少，脉细数，全身伴五心烦热、潮热盗汗、遗精等。

表1 Leber遗传性视神经病变基因位点、性别、中医证候与平均视力的关系

Leber遗传性视神经病变属于中医眼科“青盲”的范畴。中医证候上LHON与肝肾关系最为密切。中医认为肝开窍于目，经脉上连目系，“肝受血而能视”，“肝和则目能辨五色矣”。“肾为先天之本”，肾主藏精，精能生髓，脑为髓海，目系内通于脑。肝肾同源，精血相互化生。因此，肝肾与目系的关系最为密切，正如张景岳所说“肝肾之气充则神采光明”。本组研究中发现在三个原发位点突变的LHON患者中，肝郁阴虚型视力最差，而肝肾阴虚型视力反而较好，考虑与LHON的发病特点及采用的中医辨证方法有关，由于本病有一定的自行恢复特点，而我们辨证采用的是辨病、辨证相结合的方法，肝经郁热及肝郁阴虚型患者正值疾病的进展期，而有些晚期LHON患者，眼底视盘颜色苍白，表现为视神经萎缩，见舌质红、脉细，辨证为肝肾阴虚，而这些患者可能已经经历了视功能的自我恢复过程，因而视功能反而好于肝经郁热及肝郁阴虚型。以上研究结果提示我们，LHON发病与肝肾关系最为密切，在治疗上应注重解肝郁，养肝血，滋肾阴，尤其在本病的中期，表现为肝郁阴虚，视功能受损严重，治疗上应倾向于疏肝解郁，滋阴明目为主。

［1］Leber T.Ueber hereditaere und congenital angelegte sehnervenleiden［J］.Graefes Arch Ophthal，1871，17（2）：249-291.

［2］Wallace DC SG，Lott MT，Hodge JA，et al.Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy［J］.Science，1988，242（4884）：1427-1430.

［3］Johns DR，Heher KL，Miller NR，et al.Leber's hereditary optic nerropathy：clinical manifestations of the 14484 mutation［J］.Arch Ophthalmol，1993，111（4）：195-198.

［4］Miller NR，Newman NJ.Walsh&hoyt's clinical neuro-phalmology［M］.5thed，Baltimore：Williams&Wilkins，1999：304.

［5］Gueven N，Faldu D.Therapeutic strategies for Leber's hereditary optic neuropathy：A current update［J］.Intractable Rare Dis Res，2013，2（4）：130-135.

［6］La Morgia，Carbonelli，Barboni.Medical management of hereditary optic neuropathies［J］.Front Neurol，2014，31（5）：141.

［7］周剑，孙艳红，韦企平.Leber遗传性视神经病变的中医体质学思考［J］.中国中医眼科杂志，2010，20（4）：232-234.

［8］孙艳红，韦企平，周剑，等．Leber遗传性视神经病变14484位点突变的中医体质学研究［J］．中国中医眼科杂志，2009，19（5）：270-273．

［9］孙艳红，韦企平，周剑，等.Leber遗传性视神经病变的中医体质学研究［J］.北京中医药大学学报，2013，36（5）：349-352.

［10］张铭连，石慧君，常永业.Leber遗传性视神经病变患者的线粒体DNA检测及中医治疗分析［J］.河北中医，2007，29（1）：51-53.

［11］张铭连，石慧君，庞朝善.Leber遗传性视神经病变患者的线粒体DNA检测及中医辨证分析［J］.中国中医眼科杂志，2006，16（1）：9-11.

Analysis of clinical characteristics and TCM syndrome on three primary mutations of Leber hereditary optic neuropathy

XIE Shiming，WANG Hao，CHANG Yongye，et al.Hebei Eye Hospital，Hebei Institute of Ophthalmology of TCM，Xingtai 054001，China

OBJECTIVE To investigate the three primary pathogenic mutations in Leber hereditary optic neuropathy caused by dialectical law of medicine.METHODS Retrospectively analysed the characteristics of TCM differentiation of syndromes，the relationship between the syndromes and three primary mutations links，and summarized Leber's hereditary optic neuropathy TCM law for 219 patients with ND4 G11778A，ND6 T14484C，ND1 G3460A mitochondrial DNA mutation-positive cases of Leber's hereditary optic neuropathy symptoms from December 2001 to December 2013 in Hebei Provincial Eye Hospital（former Xingtai City Eye Hospital）.RESULTS Among 219 cases，ND4 G11778A mutation was in 188 cases，ND6 T14484C mutation in 23 cases，ND1 G3460A mutation in 8 cases.Among TCM Ganjing Yure107cases，ND4 G11778A mutation was in 93 cases，ND6 T14484C mutations in 9 cases，ND1 G3460A mutation in 5 cases；Ganyu Yinxu 45 cases，ND4 G11778A mutation was in 38 cases，ND6 T14484C mutations in 6 cases，ND1 G3460A mutation in 1 case；TCM for Ganshen Yinxu 67 cases，58 cases was in the ND4 G11778A mutation，ND6 T14484C mutations in 7 cases，ND1 G3460A mutation in 2 cases. CONCLUSIONS With three primary mutations in patients with Leber's hereditary optic neuropathy TCM most closely connected with the liver and kidney，early stage showed excess syndrome，mid-term was mixed，and late stage was deficiency syndrome.

Leber hereditary optic neuropathy；TCM syndrome；mitochondria；gene mutation

R774.6

A

1002-4379（2015）05-0331-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.05.006

国家临床重点专科建设项目经费资助（编号zk0301yk005）河北省科技支撑计划（编号：11276103D-12）

河北省眼科医院，河北省中医眼科研究所，河北省眼科学重点实验室，邢台054001

张铭连，E-mail：zhmlyk@sohu.com