水蛭渗滤液对猴RF/6A细胞表达TNF-α的影响

储 俐 郑燕林 李 妍 马素红

水蛭渗滤液对猴RF/6A细胞表达TNF-α的影响

储 俐1郑燕林2李 妍3马素红4

目的观察水蛭渗滤液对凝血酶诱导下猴脉络膜-视网膜（内皮）细胞（RF/6A）表达促血管生成因子TNF-α的影响。方法采用消化培养法，对猴RF/6A细胞进行体外传代培养，选择20 μ/ml的凝血酶作为诱导浓度，分别作用于RF/6A细胞2、4、6、8、10、12及24 h，用ELISA法观察凝血酶对视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的诱导情况。观察在有或无凝血酶诱导下水蛭渗滤液（64 mg/ml）对视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的影响。结果（1）凝血酶作用2 h，TNF-α的表达开始增加，作用4 h，TNF-α的表达达到最大，持续至10 h；4、6、8 h与空白组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；当凝血酶作用时间达12 h，TNF-α的表达开始下降，凝血酶组与空白组12 h和24 h比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）水蛭渗滤液对有或无凝血酶诱导组都能下调TNF-α的表达（P＜0.05）。结论水蛭渗滤液能下调凝血酶诱导下猴RF/6A细胞表达TNF-α。

水蛭渗滤液；凝血酶；视网膜血管内皮细胞；TNF-α

视网膜新生血管（retinal neovascularization）病变，能导致严重的中心视力损害，目前临床治疗方法有手术切除、黄斑转位、激光光凝、光动力疗法等，但是一旦视力受损，大多数治疗对于视力的恢复是有限的，还有可能加速新生血管的生成或是损伤正常视网膜组织；另外，视网膜新生血管仍有复发的可能，而且这些治疗的费用不菲。

我们前期的实验发现，64 g/L水蛭渗滤液可以抑制血管内皮细胞的增殖，将细胞阻滞在G1期〔1〕，同时，水蛭渗滤液可使内皮细胞跨膜受体VEGF R2表达明显减少〔2〕，从一定层次说明水蛭对视网膜新生血管有抑制作用。但是水蛭是如何防治视网膜新生血管性疾病的机制目前尚不清楚。本研究通过观察水蛭渗滤液对凝血酶诱导下的视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的情况，力图从另一角度初步探讨水蛭防治视网膜新生血管性疾病的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及主要试剂：恒河猴视网膜血管内皮细胞（rhesus retinal endothelial cell，RF/6A，上海中国科学院细胞库）。水蛭（四川新荷花中药饮片有限股份公司，产地：山东，批号：070301）。RPMI 1640培养基（Gibco BRL，美国），特级胎牛血清（北京元亨公司，中国），胰蛋白酶（Gibco BRL，美国），PBS平衡盐溶液（北京中杉生物技术有限公司，中国），凝血酶（Sigma公司，美国），中药水蛭渗滤液（成都中医药大学附属医院制剂科，批号：2007030201），TNF-α酶联免疫试剂盒（Sigma公司）等。

1.1.2 主要实验器材：M-Q型超净工作台（Heraeus公司，德国），CO2培养箱（Sanyo公司，日本），Herzeus varifuge 3.0RS型低速离心机（Kendro公司，美国），1-13型高速离心机（Sigma公司，美国），Mili-Q型超纯水系统（Milipore公司，美国），550型酶标仪（Biorad公司，美国），MO-18型倒置像差显微镜（Olympus，日本）等。

1.1.3 实验用水蛭渗滤液的制备：取水蛭，60～65℃干燥3小时，粉碎成粗粉，照2005年版《中国药典》一部流浸膏剂与浸膏剂项下的渗滤法，用60%乙醇作溶剂，浸渍48 h后，收集渗滤液，回收乙醇至无醇味，定容，调整pH值至6.5～7.5，静置，取上清液，滤过（0.45微孔滤膜），即得。本品每1 ml含抗凝血酶活性为24.0 μ。取1 ml水蛭提取原液（5 g/ml）加入38 ml DMEM液中，保存浓度为128 mg/ml，调pH值为7.4。过滤除菌，4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞的传代培养及鉴定：恒河猴视网膜血管内皮细胞的传代培养及鉴定：0.25%胰蛋白酶消化后，用完全1640培养液制成内皮细胞悬液，调整细胞浓度接种到培养瓶内，每2～3 d换液1次。恒河猴视网膜血管内皮细胞80%融合后，消化传代培养，取传2代细胞，采用Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法在光镜和电镜下观察细胞形态并进行细胞鉴定。1.2.2凝血酶诱导RF/6A细胞表达TNF-α的测定：选取指数生长的RF/6A细胞，按3×104个/ml的单细胞悬液，每孔200 μl接种于96孔培养板，加入20 NIHU/ml凝血酶溶液，空白组只加入RPMI1640，分别培养2、4、6、8、10、12及24 h。取上清液，离心后分装于EP管中。建立标准曲线后，取分装于EP管中的细胞培养上清液，以每孔100 μl注入经Ⅰ抗包被的96孔酶标板中。置孵箱中反应90 min。按每孔100 μl依次加入亲和素——过氧化物酶复合物（ABC）液，置孵箱中反应60 min。洗板5次后，按每孔90 μl加入TMB显色液，置于孵箱中反应10 min。按每孔100 μl依次加入TMB终止液。用酶标仪在450 nm测定光密度D（450 nm）。

1.2.3 水蛭对凝血酶诱导下RF/6A细胞表达TNF-α的影响：取指数生长的RF/6A细胞，按3×104个/ ml的单细胞悬液，每孔200 μl接种于96孔培养板，培养24 h，细胞贴壁生长。弃原培养液，加入无血清的RPMI1640培养液200 μl，培养24 h，使细胞相对同步化。弃原培养液，随机分成空白对照组（只加入RPMI1640培养液），凝血酶组（加入以RPMI1640培养液配制的20 NIHU/ml凝血酶溶液），水蛭渗滤液组（加入以RPMI1640培养液配制的水蛭渗滤液64 mg/ml）和合药组（同时加入凝血酶溶液以及水蛭渗滤液），同时孵育10 h。取上清液，离心后分装于EP管内。建立标准曲线后，吸取分装于EP管中的细胞培养上清液，以每孔100 μl注入经Ⅰ抗包被的96孔酶标板中。弃酶标板内液体，按每孔100 μl依次加入生物素抗TNF-α抗体，置孵箱反应60 min。洗板3次后按每孔100 μl依次加入亲和素——过氧化物酶复合物（ABC）液，置于孵箱反应60 min。再洗板5次，按每孔90 μl依次加入已经平衡30 min的TMB显色液，加盖，置孵箱避光反应10 min。按每孔100 μl依次加入TMB终止液。用酶标仪在450 nm测定光密度D（450 nm）。

1.3 统计学方法

所有数据资料采用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理。计量资料用x±s表示，组间差异性比较用单因素方差分析。多组间两两比较用S-N-K检验，不同时间点两组组间及组内比较采用重复测量资料的方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血管内皮细胞鉴定

细胞膜表面见棕黄色阳性颗粒（第Ⅷ因子相关抗原），即免疫组化染色为阳性反应，证实细胞类型为血管内皮细胞（图1）。

2.2 凝血酶对体外培养的RF/6A细胞表达TNF-α的影响

两组RF/6A细胞不同时间点的TNF-α表达量不同（重复测量方差分析，同组内不同时间点比较：空白组TNF-α的含量间差异无统计学意义（F=0.483，P=0.666）。凝血酶组TNF-α的含量间差异有统计学意义（F=12.98，P=0.00）；时间与组别之间存在交互效应，说明凝血酶组和空白对照组的TNF-α含量随时间变化趋势有所不同，交互效应F=4.283，P=0.008）；交互效应F=4.283，P=0.008），凝血酶组TNF-α表达在2、4、6、8、10 h时高于空白对照组（P＜0.05），在12、24 h时与空白对照组接近（P＞0.05）。从时间变化上看，空白对照组的TNF-α表达较为平稳，凝血酶组的TNF-α表达则表现为先升高后下降的趋势（表1）。

2.3 蛭渗滤液对凝血酶诱导RF/6A细胞TNF-α表达的影响

凝血酶组、空白对照组、水蛭组以及合药组TNF-α表达的光密度值分别为0.075±0.002，0.061± 0.003，0.039±0.003，0.045±0.002，四组差异有统计学意义（单因素方差分析，F=53.42，P＜0.05）。水蛭组及合药组的TNF-α表达均低于凝血酶组及空白对照组，合药组的TNF-α表达为最低（S-N-K法，P＜0.05）。

图1 细胞膜表面见棕黄色阳性颗粒（第Ⅷ因子相关抗原），证明是血管内皮细胞光镜100×

3 讨论

视网膜新生血管的形成是一个复杂的过程，其中，血管内皮细胞是关键靶细胞〔3〕，同时，促血管生成因子，如TNF-α、VEGF等的过度表达是视网膜新生血管形成的重要环节。平时在外周血液循环中，血管内皮细胞处于血管生成因子和抑制因子的复杂精细平衡稳态下，因此局部的血管生长处于静止状态〔4-6〕。凝血酶则是视网膜新生血管性疾病中打破这一平衡最为常见和关键的诱因。视网膜新生血管性疾病是一种以视网膜反复出血为主要特征的疾病，一旦出血则导致局部凝血酶表达的极度上调，这也将诱导大批的促血管生成因子如TNF-α的分泌增加，从而打破血管生成微环境的平衡，诱导视网膜新生血管的生成〔7-8〕。

视网膜新生血管性疾病属中医“眼底血症”范畴，中医药在阻止视网膜新生血管性疾病病情进展方面有较好的疗效。唐容川在《血证论》中明确指出“血症当以祛瘀为要”，临床眼科医家对视网膜出血性疾病也始终以祛瘀为基本治法，取得了很好的疗效〔9-12〕。在这一理论的指导下，成都中医药大学附属医院眼科研制的以水蛭为主药的“化瘀散结片”已经在临床运用和研究多年，临床疗效良好〔13-14〕。

3.1 凝血酶对视网膜内皮细胞表达TNF-α的诱导

凝血酶与细胞表面的凝血酶受体即蛋白酶活化受体（protease-activated receptor，PAR）结合，引起受体活化〔15〕，受体活化后进一步激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）〔16〕，使IkB磷酸化降解，与NF-κB解离，暴露NF-κB的核识别位点，使NF-κB进入核内，促进TNF-α基因的转录。本研究发现，凝血酶能够在2、4、6、8、10 h诱导TNF-α表达的增加，并且在10 h达高峰，差异有统计学意义（P＜0.05），凝血酶能够上调视网膜血管内皮细胞对促血管生成因子TNF-α的表达，从一定程度上诱导视网膜新生血管的形成，这与国外的研究报道有相似之处〔17-18〕。

有研究发现〔19〕，在体内NF-κB的激活过程受精细的反馈调节调控。正反馈调节：NF-κB激活后，可增强TNF-α和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等的基因转录，促使TNF-α和IL-1β产生和释放增多，后者又导致NF-κB的进一步激活。负反馈调节：当细胞内NF-κB激活时，胞质内IkB的mRNA表达和蛋白合成增强。本研究发现，凝血酶作用2 h，TNF-α的表达开始增加，作用4 h，TNF-α的表达达到最大，持续至10 h；当凝血酶作用时间达12 h，TNF-α的表达开始下降，经统计学分析，凝血酶组与空白组12 h和24 h，TNF-α的表达间差异无统计学意义。因此推测12 h可能是负反馈调节的节点，这还有待进一步深入研究证实。

3.2 水蛭渗滤液对凝血酶诱导下视网膜内皮细胞表达TNF-α的影响

过去20年的广泛深入研究发现，水蛭素含有与凝血酶受体相似的结构——K51YEPF55，它能与凝血酶结合从而阻止凝血酶与其活性受体PAR-1的结合〔20-21〕，使凝血酶无法进一步发挥其生物学反应。本研究发现，水蛭渗滤液能够抑制凝血酶诱导下的TNF-α表达，合药组TNF-α表达低于凝血酶诱导组（P＜0.05），推测水蛭渗滤液对视网膜血管内皮细胞TNF-α表达的下调，是通过对凝血酶的阻断来实现的。

同时，本研究也发现，水蛭渗滤液单独作用组的TNF-α表达也低于空白组。这是否与TNF-α表达相关的PKC、PKA的激活有关呢？还是与其他途径有关。这还有待于今后更进一步的深入研究。

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Effect of leech extract on thrombin induced monkey RF/6A cell in expressing angiogenesis-promotingfactor TNF-α

CHU Li，ZHENG Yanlin，LI Yan，et al.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China

OBJECTIVE To observe the affection of Leech extract to RF/6A cell by thrombin-induced and to investigate the mechanism of preventive affection of retinal choroidal neovascularization.METHODS RF/6A cell cultured in vitro by digestion culture，and induced by thrombin（20 μ/ml，2，4，6，8，10，12，24 hour）to observe the express of TNF-α cytokine.Simultaneously，we observed the express of TNF-α by leech extract（64 mg/ml）to RF/6A cell，with or without thrombin-induced.RESULTS The leech extract could decline the TNF-α express of RF/6A cell，with or without thrombin-induced.CONCLUSIONS Leech extract could prevent the retinal vascular disease，from a certain extent，by blocking thrombin activation to reduce retinal angiogenesis factor TNF-α expression to achieve.

leech extract；thrombin；retinal endothelial cell；TNF-α

R285

A

1002-4379（2015）05-0314-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.05.002

中国国家博士点基金资助课题（编号：20050633003）

1成都中医药大学，成都610072

2成都中医药大学附属医院眼科

3四川省泸州医学院附属中医医院眼科

4云南省中医学院附属医院眼科

郑燕林，E-mail：zyl3327@163.com