转基因小鼠特异性免疫效应淋巴细胞影响乙型肝炎病毒复制的体外研究

宋红丽，郑卫萍，杨洋，刘涛，吴本娟，付楠楠，张友成，沈中阳

（1.天津市第一中心医院器官移植中心，天津市器官移植重点实验室，天津 300192；2.天津市儿童医院，天津 300074）

目前肝移植术后预防乙型肝炎（乙肝）复发的常用方案为小剂量乙肝免疫球蛋白（HBIG）联合核苷类似物，并取得了良好的效果［1］。但是长期应用HBIG和核苷类似物药物费用很高，对患者和社会来说负担沉重；同时作为生物制品的HBIG日益短缺，使部分患者不能坚持有效预防乙肝复发的方案，而且长期使用核苷类似物容易导致病毒耐药［2］。术后乙肝疫苗的应用，使患者看到了停用抗病毒药物及HBIG的可能性，但是目前由于移植术后免疫抑制剂的使用，使乙肝疫苗治疗有效性较差［3-4］。如果能够寻找出经济有效的新方法，从而使乙肝患者移植术后彻底停用抗病毒药物，将在该领域取得突破，获得重大的经济和社会效应。

肝移植是各类终末期肝脏疾病的主要治疗手段，在中国，其中70%～80%为乙型肝炎病毒（HBV）导致［5］，患者通常在等待肝移植手术时机的同时接受抗病毒治疗以降低体内HBV DNA的复制水平［6］，同时术前HBV DNA的水平也是术后HBV复发的重要预测指标。因此，提高患者主动免疫力、降低等待移植患者体内HBV DNA水平，已成为预防术后乙肝复发的重要目标。树突状细胞（DC）是机体内能激活初始T细胞主要的抗原呈递细胞（APC），其强大的抗原呈递能力是连接机体固有免疫和适应性免疫的桥梁［7］，因此，DC在各类病毒感染、肿瘤免疫中扮演着重要角色［8］。DC作为体内功能最强大的APC，可以通过对抗原的摄取、加工处理呈递给T细胞启动相应性免疫应答，从而增强患者体内特异性杀伤HBV的能力，提高患者的主动免疫力。T细胞亚群的调节紊乱，也是HBV在体内持续复制的主要原因［9］。本研究主要通过观察转HBV基因小鼠DC刺激自体淋巴细胞对体外HBV复制，尤其对cccDNA的作用，来评价HBV感染后特异性免疫功能的变化及其与HBV复制水平的关系。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂：FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（美国Biotek公司）；DC生成培养基DXF（德国PromoCell公司）；淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；胎牛血清（FBS，奥地利PAA公司）；干扰素（IFN）-γ-APC、白细胞介素（IL）-4-藻红蛋白（PE）单抗（美国BD Pharmingen公司）；CD80-APC/CD86-FITC/CD11C-FITC MHC-Ⅱ-PE/CD83-PE（美国BD公司）；乙肝核心抗原/乙肝表面抗原（HBcAg/HBsAg）（英国 Peprotech公司）；IL-10、IL-2和IFN-γ的ELISA试剂盒（中国Biovalue公司）。

1.2 研究对象：HBV全基因转基因C57 BL/6J小鼠［10］由上海南方模式生物科技发展有限公司提供；HepG 2.2.15细胞株由北京军区302医院赠送。

1.3 实验分组：A组为淋巴细胞（LC）+未成熟DC组；B组为HepG 2.2.15 +未成熟DC + LC组；C组为LC +负载HBV相关抗原刺激的成熟DC组（成熟DC组）；D组为HepG 2.2.15 +成熟DC + LC组；E组为HepG 2.2.15组。

1.4 实验方法

1.4.1 淋巴细胞的获取：无菌制备C57BL/6J小鼠脾和胸腺的细胞悬液，将淋巴细胞悬液移到离心管中的细胞分离液（Percoll）淋巴细胞分离液上面，使其具有明显分层。以2 000 r/min离心20分钟，吸取中间白膜层，再以1 000 r/min离心8分钟，弃去上清。最后用含0.05%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，计数后加入培养液转移到培养板中共培养。

1.4.2 提取HBV转基因鼠的DC进行培养及形态学观察：取6～8周（体重18～22 g）的HBV全基因转基因C57BL/6小鼠，断颈椎处死，按以下步骤进行操作：取股骨及胫骨骨髓，PBS冲洗，离心弃上清，收集骨髓细胞；加入5 ml已预热37℃的红细胞裂解液，除去红细胞；加入5倍体积RPMI 1640培养液稀释，离心（1 500 r/min，5分钟）；用含100 ml/L 胎牛血清（FCS）的RPMI 1640的完全培养液重悬，调整细胞密度为1×109/L，加入到6孔板中，每孔2 ml；37℃、50 ml/L CO2培养箱中培养。加入新鲜RPMI 1640完全培养液，同时添加rGM-CSF（终浓度为 10 ng/ml）和 rIL-4（1 ng/ml）于骨髓细胞中；第2天去除未贴壁的细胞；第4天半量换液，并补充细胞因子rGM-CSF和rIL-4（浓度同前）；第6天成为不成熟的DC，倒置显微镜下观察细胞形态和数量变化。

1.4.3 成熟的DC获取：将培养至第8天的DC分别用HBV相关蛋白HBsAg（19.6 μg/ml）和HBcAg（10 μg/ml）诱导，第10天细胞即转为带有HBV的抗原成熟的DC。通过流式细胞仪检测DC表面标志物CD80、CD86、CD83等的表达。

1.4.4 免疫效应细胞（IEC）的制备及检测：成熟的DC刺激自体淋巴细胞（DC︰淋巴细胞＝1︰10），经过10余天的培养及活化，制备成IE细胞（CD8+为主）并进行不断的分裂与增殖。应用流式细胞仪测定淋巴细胞表面标志物。

1.4.5 ELISA法检测上清中的IL-10/IFN-γ/IL-2的分泌：按照试剂盒说明书步骤来操作，显色后在450 nm波长下检测吸光度（A）值。

1.4.6 IEC与HepG 2.2.15细胞进行混合培养，并检测免疫细胞对HepG 2.2.15细胞中cccDNA及HBV DNA水平的影响：免疫效应细胞与HepG 2.2.15细胞混合于6孔板，效靶比为1︰10，在37℃、50 ml/L CO2培养箱中共培养24、48和72小时，每组设3个空白孔。收集混合细胞上清及细胞，进行cccDNA及HBV DNA水平的检测。

1.4.7 流式细胞仪检测DC表面分子：用流式细胞仪对DC表面标志物CD80/CD83/CD86、MHCⅡ/CD11C进行检测，按试剂盒说明书进行操作。

1.4.8 生物化学方法检测上清液的肝功能指标。

1.4.9 实时荧光定量PCR方法检测血清及细胞内HBV DNA：使用ABI 7500实时定量PCR仪（Applied Biosystems），操作按PCR试剂盒说明书进行（上海Kehua公司）。

1.4.10 HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）检测：采用实时定量PCR方法检测细胞内的cccDNA，具体方法见参考文献［11］。

1.5 统计学处理：采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism5软件做图。

2 结 果

2.1 检测HBV全基因转基因C57BL/6J小鼠血清的HBsAg、HBeAg、HBV DNA均阳性，而肝细胞内的cccDNA阴性。肝功能、肾功能等正常。

2.2 成功获取转HBV基因鼠骨髓中的DC细胞

2.2.1 DC形态学变化：第1天，镜下观察可见贴壁的圆形单核细胞，细胞体积小，数量多，无突触；第3天，细胞体积逐渐变大，由规则的圆形向长条状进展；第6天，细胞体积明显增大，细胞表面伸出短的突触（图1a）。按第6天DC细胞是否负载HBsAg和HBcAg抗原肽分为负载抗原成熟组和未负载抗原未成熟组，第8天负载抗原成熟组的细胞大量悬浮，小而圆的单核细胞逐渐消失，细胞表面都伸出两个或多个突触，细胞体积大，突触明显，未分化的单核细胞较少（图1b）。图1c、1d显示出由未成熟到成熟的DC表型的典型变化。

2.2.2 DC表面标志的变化（表1）：与培养6天未成熟DC相比，负载抗原成熟的DC表面标志物CD11c/MHC-Ⅱ、CD83、CD80、CD86的表达在成熟DC中均明显增高（均P＜0.05），说明在体外环境HBV相关抗原可以刺激体外DC的成熟。

图1 未成熟与成熟DC形态比较（a、b均为低倍放大）

表1 未成熟DC与成熟DC表型变化比较（±s）

表1 未成熟DC与成熟DC表型变化比较（±s）

注：与未成熟DC组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

标志物 样本数 未成熟DC 成熟DC CD11c+MHC-Ⅱ+ 3 45.77±4.53 95.50± 4.07 CD80 3 20.07±2.66 64.00±10.66 b CD86 3 16.37±6.91 29.77± 4.48 a CD83 3 86.83±2.89 98.37± 0.97 b

2.3 特异性效应性淋巴细胞对HepG 2.2.15细胞的肝功能及上清HBV DNA的影响：

2.3.1 D组与B组细胞上清液HBV DNA变化 （表2；图2）：D组在24、48和72小时细胞上清HBV DNA均较E组明显下降（均P＜0.01），B组细胞上清HBV DNA水平也较E组有所下降，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。说明特异性的成熟DC刺激的淋巴细胞能有效地抑制体外HBV的释放，但与B组相比，D组作用更显著。

表2 各组不同时间点细胞上清液HBV DNA变化（±s）

表2 各组不同时间点细胞上清液HBV DNA变化（±s）

组别 样本数 HBV DNA（×106）24小时 48小时 72小时D 组 3 0.95±0.07 1.10±0.58 1.04±0.16 B 组 3 1.99±1.18 1.80±0.12 1.90±0.25 E 组 3 3.45±0.50 2.82±1.17 4.09±1.99

2.3.2 各组间肝脏酶学的变化（图2）：在48和72小时B组和D组肝细胞丙氨酸转氨酶（ALT）水平有下降趋势，与E组相比差异有统计学意义。天冬氨酸转氨酶（AST）水平虽然有上升趋势，但差异没有统计学意义。说明免疫细胞与异种肝细胞之间混合培养，并不能导致细胞间的排斥反应发生，可能有保护肝细胞膜的作用。

2.4 特异性免疫效应淋巴细胞对HepG 2.2.15细胞内HBV DNA和cccDNA的影响（表3）：成熟DC与LC作用（C组）24、48和72小时后，HepG 2.2.15细胞内的HBV DNA和cccDNA表达均明显下降，与E组相比差异有统计学意义（均P＜0.05）。未成熟DC与LC作用（A组）24、48和72小时后的HepG 2.2.15细胞内的HBV DNA和cccDNA表达亦均有下降，但与E组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结果提示由HBV相关蛋白刺激的转HBV基因鼠的DC刺激自体淋巴细胞后对体外HepG 2.2.15细胞中的HBV有显著的抑制作用，对细胞内HBV cccDNA的复制及HBV DNA的分泌均有抑制作用。而未成熟DC组抑制HBV复制作用较成熟DC组作用弱。B组与D组在24、48和72小时对HBV DNA和cccDNA均有抑制作用，D组的作用更明显，与E组比较有统计学意义（P＜0.05）。而B组与E组比较无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组对HepG 2.2.15细胞上清的肝功能与HBV DNA的影响

表3 各组不同时间点对HepG 2.2.15细胞内HBV DNA和cccDNA的影响

2.5 各组淋巴细胞亚群的变化（图3）：将成熟DC或不成熟DC与淋巴细胞共刺激后再与HepG 2.2.15细胞共培养，观察CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+/ CD3+CD8+比值的变化，结果提示，随着DC由不成熟到成熟，CD3+CD4+及CD4+/ CD8+比值先下降后升高；而CD3+CD8+比例变化不明显。说明成熟DC刺激的淋巴细胞在24小时以CD3+CD8+作用为主发挥免疫作用，48小时以后则以CD3+CD4+阳性细胞作用为主。

对CD3+CD4+细胞的影响：B、C、D组在24、48和72小时分别与A组相比差异均有统计学意义（均P＜0.01），A组与B组、C组与D组相比差异也均有统计学意义（均P＜0.01），表现为24小时先下降，48小时以后升高，而CD3+CD8+比例各个时间点均无明显变化。

CD4+/ CD8+比值：C组较A组CD4+/ CD8+比值明显降低；D组较C组CD4+/ CD8+比值在24小时明显降低，48小时和72小时上升，差异有统计学意义（P＜0.01）；D组较B组CD4+/ CD8+比值在24小时明显下降（P＜0.01），48 小时和72小时明显升高，48小时差异有统计学意义（P＜0.05），而72小时差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6 IEC与HepG 2.2.15细胞共培养后上清液的细胞因子水平变化（图4；表4）：A组与B组、C组与D组细胞上清液的IL-2和IFN-γ分泌水平在24、48和72小时均为上升趋势，且差异均有统计学意义（均P＜0.05）；各个时间点D组与B组水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且不随时间而变化；C组与A组比较24小时时IFN-γ分泌量无明显差异，而IL-2分泌量差异有统计学意义，其他时间点均有意义，但不随时间变化而变化；C组与A组比较24和72小时IFN-γ无明显差异。

图3 各组C57BL/6小鼠淋巴细胞亚群的变化

图4 各组细胞上清液的IL-2、IFN-γ和IL-10分泌量的变化

IL-10的变化却相反。A组与B组24小时呈下降趋势，48小时和72小时时均呈上升趋势（均P＜0.05）；C组与D组24、48和72小时均呈下降趋势（均P＜0.05）；C组与A组24小时IL-10分泌量无明显差异，D组与B组则有显著差异（P＜0.01）。但不随时间变化而变化。

提示DC刺激淋巴细胞对体外HepG 2.2.15细胞作用后都能产生较高的IL-2、IFN-γ和较低的IL-10。但成熟DC较未成熟DC的作用更明显。

表4 各组不同时间点、HepG 2.2.15细胞上清液细胞因子水平变化比较（±s）

表4 各组不同时间点、HepG 2.2.15细胞上清液细胞因子水平变化比较（±s）

注：B组与A组比较，aP＜0.05；D组与C组比较，bP＜0.05；C组与A组比较，cP＜0.05；D组与B组比较，dP＜0.05

组别 样本数 IL-2（pg/ml）24小时 48小时 72小时A 组 3 71.36±5.85 67.09±1.92 67.36±3.26 B 组 3 97.90±8.21a 92.60±2.43a 89.69±4.25a C 组 3 44.15±5.41c 50.36±4.26c 48.70±1.43c D组 3 80.09±4.54bd 85.74±4.91bd 82.62±3.07bd组别 样本数 IFN-γ（pg/ml）24小时 48小时 72小时A 组 3 416.87±24.01 396.73± 78.30 438.61±111.85 B 组 3 534.77±16.41a 595.45± 57.15a 678.58± 39.31a C 组 3 425.79±23.83 597.08± 88.69c 497.99±104.50 D 组 3 830.95±75.12bd 953.64±109.19bd 909.97±117.39bd组别 样本数 IL-10（pg/ml）24小时 48小时 72小时A 组 3 532.16±16.52 383.97±24.87 420.38±19.83 B 组 3 420.13±43.59a 444.92±10.53a 479.56±32.06a C 组 3 572.08±21.72 525.04±41.05c 560.78±33.48c D 组 3 338.95±31.37bd 323.65±22.55bd 333.38±33.67bd

3 讨 论

多数学者认为，发生慢性病毒性肝炎及病毒持续感染的机制除了取决于病毒本身的生物学特性外，更重要的是与宿主自身的免疫功能状态有关。利用自身的免疫细胞培养识别标靶特异抗原的淋巴细胞，以特定方法促使功能性淋巴细胞增殖，制成高纯度、特异识别以及有杀伤标靶细胞（例如肿瘤、病毒感染的细胞等）功能的IEC。IEC的特点在于除了含有多种免疫活化所需的功能性细胞外，还可以促使免疫反应更加完整、活跃，达到高效清除病原的目的。有研究表明，提取患者自身DC，在体外经过HBcAg刺激后回输到体内能够促进T细胞免疫，从而抑制病毒复制和改善肝功能［12］。而Weiwei等［13］发现，通过HBcAg活化的DC能够产生针对于HBV特异性的CD8+细胞反应。

本研究提取转HBV基因C57BL/6小鼠DC及淋巴细胞，通过不同的HBV蛋白刺激DC成熟，并通过成熟的DC与淋巴细胞共培养得到IEC，在体外HepG 2.2.15细胞（含有完整的HBV基因）共培养，结果显示了细胞间并没产生异种细胞间的排斥反应，肝细胞的ALT有变化，但与对照组比较差异没有统计学意义，而ALT有下降趋势，故免疫细胞疗法不会造成肝细胞的严重损伤［14］，可能有修复肝细胞膜的作用。提示我们采用的体外处理方法对HBV的研究是可行的。其次我们发现，HBV相关抗原刺激的成熟DC与淋巴细胞共刺激组较未成熟DC与淋巴细胞组HepG 2.2.15细胞上清HBV DNA水平明显下降，同时细胞内的HBV DNA和cccDNA水平也明显下降。说明该种成熟DC作用后的淋巴细胞具有明显的抑制HBV cccDNA的合成以及分泌的作用。

HBV cccDNA在HBV复制过程中起关键作用，是HBV复制的突出标志，很难被清除，监测其水平被认为是目前评价抗HBV疗效或临床治愈的“金标准”。目前认为，机体通过免疫清除HBV cccDNA的途径主要为：① 通过细胞溶解机制，清除感染的肝细胞，HBV被巨噬细胞吞噬或与抗-HBs抗体结合成为免疫复合物后被巨噬细胞吞噬并从尿中排出，破坏的肝细胞由新生肝细胞替代；② 通过Th1反应介导的依赖细胞因子的非细胞溶解机制，如IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子介导非细胞裂解机制清除细胞核内的HBV cccDNA或阻断合成新的HBV cccDNA，即通过细胞因子的作用“治疗”感染［15-16］，从而清除HBV。目前在移植患者中发现可以通过供者针对HBV的过继免疫而实现HBV的清除［17］。

为了解释其原因及机制，我们检测了致敏淋巴细胞的亚群变化，发现特异性IEC在作用HBV的早期主要以CD8+细胞为主，CD4+细胞水平明显降低，CD4+/ CD8+比值显著降低，48小时以后CD4+细胞明显升高，表明IEC的抗HBV的早期作用主要是CD8+细胞发挥的，随后以CD4+T细胞作用为主；随着时间的延长，CD4+/CD8+比值上升，而细胞的HBV DNA水平明显下降，可能与在抗HBV过程中CD4+和CD8+细胞直接参与有关［18-19］。HBV DNA水平降低，CD4+/ CD8+比值却明显升高，说明IEC的亚群改变首先是CD4+/ CD8+比值的降低，而后在HBV作用后升高，并且与异种细胞间的排异反应无关。有研究表明，IEC的CD8+淋巴细胞是决定HBV清除的关键细胞亚群，细胞溶解或非溶解机制（IFN-γ和TNF-α等）是CD8+T细胞清除HBV的主要方式，而CD4+淋巴细胞主要通过分泌Thl细胞因子来抑制HBV复制［20-21］，提示此种情况下加强急性CD4+T细胞应答的治疗和疫苗的策略是有意义的。而DC是目前已知的唯一能激活Th0细胞向Thl细胞或Th2细胞分化的功能最强的抗原呈递细胞［22］。为了进一步解释其机制，我们对各组进行了细胞因子的检测。

Th1和Th2两个细胞亚群相互拮抗，Thl/Th2动态平衡是机体处于正常免疫状态的保证［23］。Thl主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-3等细胞因子，这些细胞因子诱发细胞免疫反应，增强微生物对宿主的感染，尤其是病毒与细胞内感染的免疫性和防御功能，达到清除病毒的目的；Th2主要分泌IL-10、IL-4、IL-5等细胞因子，这些细胞因子可刺激B细胞增生，产生相应抗体，诱发体液免疫反应［24］，并与感染的进展、慢性化有关。Thl/Th2的失衡应答可能是HBV感染慢性化的主要机制，这种失衡又体现在细胞因子失调方面［25］。IFN-γ、IL-2能正向调节免疫应答，清除侵入体内的病毒抗原。IL-10是一种重要的抗炎细胞因子，也可抑制Th1成熟和产生相应细胞因子，故IFN-γ、IL-2、IL-10可大致代表 Th1 / Th2的功能［26-27］。我们检测了IFN-γ、IL-2和IL-10，结果显示，HBV DNA高表达时，IFN-γ和IL-2水平下降，而IL-10均升高，HBV DNA低表达时，IFN-γ和IL-2水平上升，而IL-10水平下降。由于IFN-γ分泌增加可使CD4+T细胞向Th1分化，抑制Th2形成，从而激活HBV特异的CTL克隆增殖，杀伤HBV［28］。IL-10含量升高，且伴随病毒载量增高而增加，显示HBV致病与免疫应答中Th2介导的体液免疫活性偏高有关系。IL-10水平升高抑制了Th1群细胞的功能，使Th1分泌IFN-γ和IL-2的量减少，细胞免疫效应降低，机体清除病毒能力减弱，导致病毒持续存在［29］。有研究报道HBV感染者血清IL-10浓度明显高于正常对照组，HBV高载量组感染者血清IL-10浓度明显高于正常对照组和低载量组［30］，说明细胞因子与肝细胞中HBV DNA的消长有一定关系，特别是与肝细胞中HBV cccDNA、HBV DNA的关系需要进一步研究，以探讨cccDNA的清除与机体免疫的关系。

以往人们对血清及腹腔积液中细胞因子与HBV DNA的研究较多，但对细胞因子与肝细胞中HBV DNA及HBV cccDNA的关系却研究较少。本研究结果证实，IEC对体外HBV DNA及HBV cccDNA均有明显的抑制作用，这一结果也与其他报道［31-33］一致。通过对转HBV基因小鼠的DC处理的淋巴细胞亚群检测，可以证明体外IEC中HBV特异性的CD4+和CD8+细胞对HBV清除和疾病转归有重要影响，对体外HBV复制及分泌均有抑制作用。肝移植术后HBV再感染的病原来源于病肝释放到循环中的病毒颗粒，或者淋巴系统及淋巴细胞等肝外组织中存在的病毒［34］。而移植术后，随着大量免疫抑制剂的应用，肝移植受体术后外周血来源的DC呈递乙肝表面抗原的能力低下，针对HBV的抗原特异性T细胞应答低下，此种功能缺陷是导致受体针对HBV的主动免疫反应性低的重要原因［35］。特异修饰的DC刺激淋巴细胞可以在很大程度上减少HBV的复制，不会造成肝功能的损伤。这种疗法可能在不久的将来用于预防和治疗移植术后乙肝复发患者。

综上所述得出以下结论：① IEC与异种肝细胞体外混合培养，细胞间不产生排斥反应；② 转HBV基因鼠DC诱导的IEC对体外HBV复制有明显的抑制作用，为免疫细胞疗法在临床中的应用提供理论依据；③ Th1/Th2平衡可能在控制体外HBV复制及分泌过程中处于一个动态的平衡；④ 细胞因子在抗HBV中发挥重要作用，可能也是保护肝细胞损伤的重要因素。