磁性琼脂糖微球活化条件的研究

吴明慧 谭 坚 梁 晨

（广西梧州市环境监察支队，广西 梧州 543000）

磁性琼脂糖微球活化条件的研究

吴明慧 谭 坚 梁 晨

（广西梧州市环境监察支队，广西 梧州 543000）

对环氧氯丙烷活化琼脂糖磁性微球的活化条件进行了研究。以微球表面的环氧基密度为指标，考察了活化时间、NaOH浓度、环氧氯丙烷体积分数、NaBH4浓度和活化温度等因素对琼脂糖磁性微球活性的影响。实验结果表明，环氧氯丙烷活化琼脂糖磁性微球的最优条件为活化时间为4 h ，NaOH浓度为0.9 mol/L，环氧氯丙烷体积分数为40%，NaBH4的浓度为0.5 g/L，活化温度为40℃。

磁性琼脂糖；活化；影响因素；最优条件

磁性琼脂糖微球是一种用于蛋白质层析分离和细胞/酶固定化的载体，具有易分离回收、操作简便和成本较低等优点。磁性琼脂糖微球的活化度越高，能嫁接的亲和配基越多，悬浮吸附分离纯化蛋白质的效率就越高，更有利于扩大蛋白质生产规模[2]，因此提高磁性琼脂糖微球的活化度已经成为了研究的热点。目前，常用于载体活化的活化剂主要有环氧氯丙烷、1,4-二羟基正丁烷、双缩水甘油醚、羰基二亚胺、二乙烯基亚砜等[1]，其作用在于向载体表面引入高密度、稳定的活化基团，如氨基、环氧基、羟基、氯甲基、酰肼基等[2]。其中，环氧基是一种常用的活性基团，与其他基团相比，环氧基修饰的载体在直接固定化酶时不需要预活化，反应条件温和（温度 25℃，pH≥7.0），酶的活性在固定化过程中不易被破坏，适合固定化酶的工业化生产。此外，环氧基可与酶分子中的多种活性基团，如氨基、巯基及酚羟基、咪唑基等反应，在适合的条件下，酶与载体可发生多点键合，使得制备的固定化酶稳定性好，不易从载体上脱落。在磁性载体材料上引入环氧基不仅发挥环氧基固定化酶的优点，还易于回收使用，同时可应用磁性流动床技术使用固定化酶，具有更广泛的应用前景，因此在磁性载体表面引入环氧基具有重要的意义。在固定化载体表面引入环氧基的方法主要有溴化氰活化法、对甲苯磺酸氯活化法、环氧氯丙烷活化法。溴化氰活化法操作步骤简单，重现性好，偶联条件温和，适用于偶联敏感性生物大分子。但是溴化氰活化法形成的异脲键易产生特异性吸附，且偶联时共价键不稳定，偶联配基容易脱落，此外，溴化氰活化法操作危险性大，反应后的残余液需经处理才可排放。对甲苯磺酸氯活化法配基偶联过程中不产生新的电荷，主要用于活化含羟基基质，但活化反应需在无水丙酮中进行。缩水甘油醚活化法化学性质更稳定，配基很少脱落，分离效果好，对琼脂糖凝胶有交联作用，凝胶的刚性好，但是活化的凝胶其偶联配基密度只有溴化氰活化的 75%。环氧氯丙烷活化法是目前应用最广泛的活化方法，环氧氯丙烷试剂易得、偶联配基比较牢固，且价格低廉，操作简单易行，危险性较小。

首先采用反相悬浮包埋法制备磁性琼脂糖微球，再利用环氧氯丙烷对其进行活化。以微球表面环氧基密度为指标，考察活化时间、NaOH浓度、环氧氯丙烷体积分数和活化温度对琼脂糖磁性微球活化程度的影响，确定最优活化条件，为进一步在微球上结合各种不同官能团或直接吸附生物分子提供了可能，为琼脂糖磁性微球在生化分离中的应用提供了实验载体和理论基础。

1 材料和方法

1.1主要试剂与仪器

试剂：琼脂糖，分析纯，阿拉丁试剂有限公司；Span80，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；液体石蜡，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；石油醚分析纯，广东光华化学厂有限公司；异丙醇，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；NaOH，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；NaBH4，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；环氧氯丙烷，分析纯，广东汕头市西陇化工厂；硫代硫酸钠，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；硫酸钠，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；酚酞，分析纯，天津基准化学试剂有限公司。

仪器：DV214C电子天平、HH-S2恒温水浴锅、ZHWY-2102恒温振荡器、S212数显电子恒速搅拌器。

1.2实验方法

1.2.1磁性琼脂糖微球的制备

采用反相悬浮包埋法制备磁性琼脂糖微球[3]，具体制备过程如下：称取0. 125 g琼脂糖溶于4 mL去离子水，加热煮沸使其完全溶解，然后加入1 mL自制的Fe3O4磁流体[2]，混合均匀，作为水相；称取1.0 gSpan80加入到25 mL的液体石蜡中，恒温（80 ℃）振荡均匀后作为油相；将水相缓慢加入油相中，持续搅拌（850 rpm）10 min后冷却至室温后，再持续搅拌（250 rpm）5 min使微球成形；制得的微球用10 mL石油醚和1mL异丙醇洗涤，再分别用石油醚和去离子水清洗2次，即得到磁性琼脂糖微球。

1.2.2磁性琼脂糖微球的活化实验

称取0. 5 g磁性琼脂糖微球放入磨口锥形瓶内，依次加入一定量的NaOH溶液、一定量的NaBH4和一定体积分数（环氧氯丙烷体积与反应混合物总体积的百分比）的环氧氯丙烷，并置于恒温振荡器中，设定温度开始振荡活化。活化一定时间后，用去离子水充分洗至中性，清洗液中加入硫代硫酸钠和酚酞无显色，即得到活化的磁性琼脂糖微球。

1.2.3磁性琼脂糖微球表面环氧基密度的测定

以微球表面环氧基团的密度作为评价琼脂糖磁性微球活化程度的指标。采用硫代硫酸钠滴定法测定微球表面环氧基密度[4]，计算公式为：

其中，S为环氧基修饰密度（μmol/g），CHCl为HCl浓度（mol/L），V0和V1分别为滴定前和滴定后HCl的体积（mL），m为活化微球质量（mg）。

2 结果与讨论

2.1活化时间对环氧基密度的影响

在NaOH溶液浓度为0.9 mol/L，NaBH4浓度为0.5 g/L，环氧氯丙烷体积分数为20%，活化温度为40 ℃时，研究活化时间（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）对环氧基密度的影响。实验结果如图1所示。

图1　活化时间对微球表面环氧基密度的影响

由图 1可知，随着活化时间的增加，微球表面环氧基密度增加，在4 h时环氧基密度达到最大，其值为111.5 μmol/L。当活化时间大于4 h时，环氧自由基密度逐渐减小。可能的原因当反应时间过长时，活化反应经已基本完成，但微球表面的环氧基和环氧氯丙烷在碱性条件下的水解反应仍在继续，部分已经修饰于微球表面的环氧基由于发生水解而开环失活。因此，最佳的活化时间为4 h。

2.2NaOH浓度对环氧基密度的影响

在NaBH4浓度为0.5 g/L，环氧氯丙烷体积分数为20%，活化温度为 40 ℃，活化时间为 4 h时，研究 NaOH浓度（0.3mol/L、0.6mol/L、0.9mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L）对环氧基密度的影响。实验结果如图2所示。

图2　NaOH浓度对微球表面环氧基密度的影响

从图2可以看出，随NaOH浓度的增大，微球表面环氧基密度先呈线性增大，而后线性减小，在NaOH溶液浓度为0.9 mol/L时达到最大。琼脂糖磁性微球表面含有大量羟基，羟基接触NaOH后被激活，为下一步环氧氯丙烷的亲核取代反应提供游离基负离子[5]。NaOH作为环氧氯丙烷与琼脂糖上羟基反应的催化剂，当其浓度过低时，活化反应不完全。而且一定浓度的碱液可以保证溶液中的碳负离子的稳定性。但另一方面，环氧基易水解，而 OH-也是环氧基开环水解的催化剂[6]。因此碱液浓度过高时，增大了环氧基自身的开环和水解副反应，导致活化度反而降低。因此，活化反应中 NaOH的最佳浓度为0.9mol/L。

2.3环氧氯丙烷体积分数对环氧基密度的影响

在NaOH溶液浓度为0.9 mol/L，NaBH4浓度为0.5 g/L，活化温度为40 ℃，活化时间为4 h时，研究环氧氯丙烷体积分数（10%、20%、30%、40%、50%）对环氧基密度的影响。实验结果如图3所示。

图3　环氧氯丙烷体积分数对微球表面环氧基密度的影响

从图 3可以看出，随环氧氯丙烷体积分数的增大，微球表面环氧基密度先明显增加，后趋于稳定，在环氧氯丙烷体积分数为40%时达到最大值。说明40%体积分数的环氧氯丙烷与琼脂糖磁性微球上的羟基反应已经饱和。在环氧氯丙烷体积分数为 50%时，微球表面环氧基密度稍有下降。这可能是由于环氧氯丙烷在水中的溶解度有限(约为6.58%)[1]，环氧氯丙烷体积分数过高，其强疏水性反而不利于 NaOH 扩散，从而导致在高环氧氯丙烷体积分数时，环氧基修饰密度反而降低[7]。

2.4NaBH4浓度对环氧基密度的影响

在NaOH溶液浓度为0.9 mol/L，环氧氯丙烷体积分数为20%，活化温度为40 ℃，活化时间为4 h时，研究NaBH4浓度（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L）对环氧基密度的影响。实验结果如图4所示。

图4　NaBH4的浓度对微球表面环氧基密度的影响

由图4可知，NaBH4的浓度不断增大，NaBH4浓度在0.5g/L时，环氧基密度达到最大值；继续增加NaBH4的浓度，环氧基密度有下降的趋势。是因为在琼脂糖的活化反应中，NaBH4作为封闭剂去掩蔽琼脂糖磁性微球表面的剩余活性基团和电荷，防止或降低琼脂糖磁性微球偶联配基后剩余的活性基团相互之间的结合或电荷离子交换引起不可逆性吸附，也避免了琼脂糖微球亲和吸附蛋白质时与杂离子进行交换。但活化时NaBH4过量，会引起环氧化合物的开环反应，降低微球的表面环氧基密度[5,8-10]。因此，最佳 NaBH4浓度是0.5g /L。

2.5活化温度对环氧基密度的影响

在NaOH溶液浓度为0.9 mol/L，NaBH4浓度为0.5 g/L，环氧氯丙烷体积分数为20%，活化时间为4 h时，研究活化温度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）对环氧基密度的影响。实验结果如图5所示。

图5　活化温度对微球表面环氧基密度的影响

如图 5所示，琼脂糖磁性微球表面环氧基密度随活化温度的升高先增大后减小，40℃下反应得到的表面环氧基密度最大。活化温度升高，有利于反应的快速进行，但同时微球表面的环氧基的水解副反应、与琼脂糖微球表面其它羟基的交联反应速率也会加快，这三个反应受温度的影响程度不同。当活化温度小于40 ℃时，升高活化温度，活化反应增加的速率大于环氧基水解和交联副反应的速率；当活化温度大于40℃时，继续升高温度会导致环氧基的水解和交联副反应迅速增加，水解和交联副反应占有更强的优势，因而环氧基密度反而逐渐下降[11]。因此，最佳活化温度为 40℃。

3 结论

采用环氧氯丙烷对琼脂糖磁性微球进行了活化，考察了活化时间、NaOH浓度、环氧氯丙烷体积分数、NaBH4的量和反应温度对活化的影响，并得出了最优的活化条件。实验结果表明，环氧氯丙烷活化琼脂糖磁性微球的最有条件为活化时间为4 h，NaOH浓度为0.9 mol/L，环氧氯丙烷体积分数为40%，NaBH4浓度为0.5 g/L，反应温度为40℃。

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Study on conditions for activation of agarose magnetic microspheres

This paper investigated optimal conditions for the activation of agarose magnetic microspheres, using epichlorohydrin as activating agent. The effects of activation time, sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction，NaBH4concentration and activation temperature on activation degree were investigated，according to the density of surface epoxy group . Experimental results indicated that the optimal conditions are obtained as followed：activation time, sodium hydroxide concentration，epichlorohydrin volume fraction, NaBH4 concentration, activation temperature and is 4 h , 0.9 mol/L, 40%, 0.5 g/L, 40 ℃, respectively.

Garose magnetic microspheres; activation;influence factors;optimum operating condition

O621.2

A

1008-1151(2015)06-0045-03

2015-05-11

吴明慧（1989－），女，供职于广西梧州市环境监察支队，从事环境监察工作。