生物活性玻璃58S/丝素蛋白膜促进人牙髓干细胞增殖与分化

吕孝帅, 李正茂, 杨雪超

(广州医科大学附属口腔医院·广州口腔疾病研究所·口腔医学重点实验室, 广东 广州 510140)

·基础研究·

生物活性玻璃58S/丝素蛋白膜促进人牙髓干细胞增殖与分化

吕孝帅, 李正茂, 杨雪超

(广州医科大学附属口腔医院·广州口腔疾病研究所·口腔医学重点实验室, 广东 广州 510140)

目的: 研究生物活性玻璃58S/丝素蛋白(BG58S/SF)膜对人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖、分化的影响。方法：制备纯SF膜(A组)和1 mg/mL(B组)、 5 mg/mL(C组)BG58S/SF膜预孵育24 h后分别接种hDPSCs。于培养4、7、14、21 d时，CCK-8法检测hDPSCs的增殖能力；扫描电镜和荧光染色观察hDPSCs在膜材料表面的粘附和增殖状态；ALP活性试验评估hDPSCs的分化潜能；Real-Time PCR检测hDPSCs向成牙本质细胞分化特异性相关基因的表达水平。结果：hDPSCs在纯SF膜和BG58S/SF膜材料上粘附良好；从第7天起,与A组相比，B、C组细胞ALP活性显著增高, hDPSCs向成牙本质细胞分化特异性相关基因表达水平上调更加显著(P<0.05), 且C组均高于B组。结论：BG58S/SF膜能促进hDPSCs粘附、增殖与分化。

生物活性玻璃; 丝素蛋白; 牙髓干细胞; 组织工程

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.10.001

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(10): 577]

生物材料的发展已具有众多优良特性，但合成材料仍无法完全替代天然组织的所有功能，因此组织工程成为修复组织和器官缺损的理想方式。Hench首次发现生物活性玻璃(Bioactivity glass, BG)，因其同时具有骨引导性和骨诱导性，可控的生物降解性，良好的机械性能和较高的生物活性被广泛应用于组织工程研究[1]。有实验证实，BG可通过释放离子选择性表达成骨相关基因、上游转录因子、生长因子、信号蛋白来调节成骨细胞的活动[2]，可用于窝沟封闭[3]、抗菌[4]、牙本质过敏[5]。蚕丝蛋白是一种天然的胶状蛋白，由25%丝素蛋白(silk fibroin, SF)和75%丝胶组成，脱胶的SF具有低抗原性、可降解、良好的氧气及水蒸气渗透率[6]。有研究显示，SF作为骨及皮肤的支架材料[7]，可加速引导骨组织再生(The guided bone regeneration, GBR)的愈合[8]，减少口腔黏膜缺损修复的伤口收缩[9]及支持细胞和毛细血管附着[10]。

BG和SF都是组织工程中理想的生物材料。本研究尝试应用组织工程学方法，将人牙髓干细胞(hDPSCs)接种于含不同浓度BG58S/SF复合膜上，探究其对hDPSCs生长增殖及成牙本质细胞向分化的影响，为牙本质-牙髓复合体的再生提供新思路和新方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、双抗、胰蛋白酶-EDTA(Gibco，美国)；I型胶原酶、Trizol(Sigma，美国)；溴化锂(LiBr)、无水碳酸钠(Na2CO3)、AR(上海国药)；无蛹蚕茧(江苏兄弟药业)；透析袋(分子量3 500)(北京索莱宝)；CCK-8试剂盒、BCA试剂盒(上海贝博)；Hoechest33258(上海碧云天)；ALP试剂盒(南京建成)；SYBR Green PCR试剂盒(大连宝成)；罗明丹标记的鬼笔环肽(Cytoskeleton，美国)；熔融法制备的生物活性玻璃58S粉末[SiO2(60)-CaO(36)-P2O5(4)(wt%)](华南理工大学提供)；傅立叶红外光谱仪(FTIR)(Nicoiet，美国)；OCA15接触角仪(Dataphysics，德国)；CFX96 Real-Time PCR仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 hDPSCs的分离和培养

取18～25岁因正畸减数拔除的健康、无龋、无牙周病的前磨牙(患者知情同意)，用含100 g/L双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后，无菌条件下取出牙髓组织；在含800 g/L DMEM、200 g/L FBS双抗、1 g/L双抗的细胞培养液中剪碎后，用3 mg/mL Ⅰ型胶原酶消化离心后收集沉淀并接种于 25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱；3～4 d 换液1次，待细胞融合达80%～90%时，用2.5 g/L胰蛋白酶、2 g/L EDTA混合液消化传代，体外培养扩增；通过流式细胞仪结合间充质干细胞标志物STRO-1分选并获得hDPSCs[11]。

1.3 SF膜及BG58/SF膜的制备

取天然无蛹蚕茧60 g，在0.2 wt%的Na2CO3溶液中煮沸脱胶20 min，重复3次，脱胶后的蚕茧于60 ℃充分干燥；称取41.3 g LiBr并溶于50 mL去离子水中，同时取上述烘干的蚕茧5 g溶于其中，60 ℃水浴过夜，使蚕茧充分溶解，经透析、离心后制得SF胶状液体，4 ℃保存备用[12]。

将BG58S粉末于180 ℃下干热灭菌，分别按1、 5 mg/mL的终浓度加入到SF液中混合均匀；然后在24孔板的每个孔中分别滴加BG58S/SF悬浊液及纯SF液各200 μL，使其浸润整个孔底，紫外线消毒，自然风干；分别用傅立叶红外光谱仪(FTIR)、OCA15接触角仪检测膜材料的特性。

1.4 hDPSCs接种和实验分组

取第3代hDPSCs制备成单细胞悬液，混合均匀后, 以2×104/孔的密度接种于24孔板内的膜材料上, 分为A、B、C组：A组为纯SF膜组；B组为1 mg/mL BG58S/SF膜组；C组为5 mg/mL BG58S/SF膜组；空白对照组为无材料膜的孔板。

1.5 hDPSCs增殖与形态观察

分别于hDPSCs培养的第4、7、11、14天，用CCK-8试剂盒检测各组细胞在450 nm处的吸光度值；7、11 d时，用扫描电镜和Hoechest33258及罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色后，于正置荧光显微镜下观察细胞形态。

1.6 ALP活性检测

取第3代hDPSCs，以2×104/孔的密度接种于24孔板中，每组设6个复孔，分别于培养7、14、21 d 时弃培养液，PBS清洗2～3次后；每孔加入10 g/L TritonX-100裂解细胞，使用ALP试剂盒进行活性检测，计算各组细胞的ALP活性(以金氏单位表示)。

1.7 RT-PCR引物序列

hDPSCs分别于培养7、14、21 d后，实验组和对照组所有细胞用Trizol裂解，提取总RNA；用 1 μg 总RNA逆转录获得的cDNA为PCR模板，细胞牙源性分化及矿化检测分别用牙本质基质蛋白1(DMP-1)、牙本质涎蛋白(DSP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨涎蛋白(BSP)，管家基因GAPDH作为内参；人特异性引物序列根据Genebank发布的基因序列设计(表1)；RT-PCR使用SYBR Green PCR试剂盒，采用2-△△ct值对荧光定量结果进行分析。

表1 RT-PCR 引物序列

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 材料特性分析

2.1.1 FTIR分析

BG58S/SF膜在1 420 cm附近出现弱峰尖，样品在1 200～1 400 cm处出现光谱条带(图1)，图中虚线示特征吸收峰。

2.1.2 接触角分析

A、B、C组的接触角(θ)分别为89.5°、55.2°、46.8°，其中A组接近临界值(θ≈90°)，提示SF膜是耐水性很好的固载材料。随着BG的加入，材料的亲水性增加，且C组的接触角小于B组。本结果显示，C组的亲水性更加优良。

图1 BG58S/SF膜在培养液中浸泡7 d后的FTIR图谱

2.2 hDPSCs的增殖结果

CCK-8检测结果显示，4 d时，B、C组hDPSCs的增殖水平低于A组和对照组(P<0.05)，且A组与对照组细胞增殖水平无显著差异(P>0.05)；7 d时，B、C组细胞增殖加快，但均低于对照组和A组(P<0.05)，且B、C组增殖无显著差异(P>0.05)； 11、14 d时，C组增殖水平高于B组(P<0.05)(图2)。

*与对照组相比P<0.05；#与B组相比P<0.05

2.3 细胞形态观察结果

2.3.1 SEM观察细胞在膜材料上的生长增殖状况

SEM观察结果显示，各组hDPSCs均增殖良好，A、B、C组hDPSCs很好的粘附于材料表面。其中A呈长梭形，细胞饱满表面光滑；B、C组细胞表面粗糙，均有BG颗粒分布，且C组细胞层较B组更厚; B组细胞密集呈叠瓦状，C组可见hDPSCs伸出伪足粘附在BG颗粒表面(图3)。

2.3.2 正置荧光显微镜观察细胞骨架

细胞骨架荧光染色可见，肌动蛋白(微丝)呈红色，细胞核呈蓝色；红色的微丝呈长梭形层叠交错分布在材料表面，蓝色的细胞核被微丝包绕，所有肌动蛋白骨架舒展并覆盖在膜材料基质表面；结果显示，生物膜材料具有良好的生物相容性(图4)。

2.4 ALP活性测定

随着培养时间的增加，各实验组的ALP活性均呈现逐渐增高的趋势，各实验组各时间点的ALP活性均显著高于对照组(P<0.05)，且B、C组高于A组(P<0.05)。组间比较，第7天时，B组ALP活性显著高于C组(P<0.05)；第14天时，B、C两组无显著差异(P>0.05)；第21天时，C组ALP活性高于B组(P<0.05)(图5)。

图3 各组hDPSCs培养7、11 d时细胞形态观察(SEM，×1 000)

图4 各组hDPSCs培养7、14 d时细胞骨架形态(正置荧光显微镜, ×10)

*与对照组相比P<0.05; #与B组相比P<0.05

2.5 膜材料对hDPSCs成牙本质细胞样分化相关基因表达的影响

hDPSCs成牙本质细胞样分化相关基因DMP-1、DSP、ALP、OC、BSP在培养第7天检测到其mRNA的表达。随着培养天数增加，实验组细胞的mRNA表达均上调并显著且高于对照组(P<0.05)。组间比较显示，B、C组细胞的mRNA表达上调且显著高于A组(P<0.05)；B、C组细胞的mRNA表达上调因BG58S浓度的不同也存在明显差异(P<0.05); 第14天时，DMP-1、DSP、BSP的表达水平C组较B组高(P<0.05)(图6)。

*同时间点与对照组相比P<0.05；#同时间点与B组相比P<0.05

3 讨论

组织工程三要素是种子细胞、生物支架和生长因子微环境；基本策略是通过支架材料向靶位点输送种子细胞，并促进其增殖，分化形成靶组织。随着组织工程研究的不断深入，越来越关注支架材料的生物学性能，包括材料本身的生物学形态及与相邻软硬组织的关系和相互作用。评判一种材料的生物相容性已不是唯一指标，具有生物活性的诱导基质，并能在各阶段对细胞行为进行调控成为更理想的需求。

SF是一种天然的胶状蛋白，含有18种氨基酸，其中80%是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸，比例为3 ∶2 ∶1。氨基酸的组成与人皮肤和毛发的角质蛋白相似[13]，因此SF具有低抗原性和移植排斥反应，多孔结构有利于氧气、水蒸气及细胞新陈代谢产物的交换。SF已通过美国食品和药物管理局的批准[14]，经细胞毒性实验、溶血实验等测试，其都能满足组织工程的需要[15]。本结果发现，SF是一种临界材料(θ≈90°)，推测SF在液体条件下具有降解性，但可能需要经历较长时间。SF具有良好的生物相容性，能支持内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和成骨细胞的附着及增殖[9]。本实验将hDPSCs接种于纯SF膜上后生长增殖良好，在第4天时达到对数期；但由于其为生物惰性材料，用纯SF膜修复骨缺损在相同时间周期内，其成骨样组织量显著低于羟磷灰石[16]，提示纯SF促进细胞功能性分化的能力有限。

上世纪70年代, Hench发现了一定成分组成的玻璃在体内能与骨组织形成紧密的骨结合，并且这种玻璃对人体无不良反应，在此基础上，Hench研发出SiO2(46.1)-Na2O(24.4)-CaO(26.9)-P2O5(2.6)(wt%)四元组份的BG[17]。二十世纪九十年代新兴了一种材料制备技术——溶胶-凝胶法，它被应用于BG的制备，用此方法，Hench又研发出SiO2(60)-CaO(36)-P2O5(4)(wt%)的BG，称为58S。58S的典型结构是介孔大小(孔径在2～50 nm)，比表面积较熔融法制备的BG更大(150 m2/g)[18]，这种结构使得58S具有更快的离子交换率；因为58S具有高CaO/P2O5比率，当58S暴露于溶液介质中可形成高浓度的SiO2，从而使58S表面更快形成羟基磷灰石层且提高其生物活性[19-21]。Christodoulou等[22]研究表明，58S会显著上调RunX2、cbfa1、AP、OPN、BSP、OC等成骨相关基因来调节细胞应答，为BG用于组织工程提供了分子水平上的理论依据；既可溶性的Si4+、Ca2+等离子增加了细胞增殖，上游转录因子、生长因子、信号蛋白同时调控了骨样细胞分化。BG萃取液的缺点是在体外实验中细胞会瞬时接触高浓度的离子产物，而无法随时间累积以逐渐适应离子浓度的递增[18]。由于BG的脆性大、弯曲强度低，其在生理环境中的抗疲劳及抗破坏强度不高；而高分子材料则具有较好的塑性和抗张能力，因此，将生物玻璃与高分子材料复合可有望提高支架材料整体的力学性能，并在一定程度上能控制其离子产物缓慢释放。

FTIR分析结果显示，BG58S/SF膜在1 420 cm附近出现弱峰尖，说明矿化过程中部分CO32-基团取代了磷灰石中的PO43-基团，可认为复合材料表面的磷灰石为磷酸羟基磷灰石；SF在1 200～1 400 cm光谱带内具有其他蛋白质而没有的红外光谱特征；样品在1 655 cm处出现酰胺I带的C=O伸缩振动峰，表明SF的三股螺旋结构存在，提示其适合做生物医用材料[23]。人体中水的含量大约为65%，大部分化学反应和营养物质的运输都离不开水环境，且细胞较易在亲水的表面粘附和生长[24]。若接触角(θ)<90°则固体表面具有亲水性；θ>90°则固体表面具有疏水性; θ≈90°为临界值。本实验接触角分析显示，SF膜的表面接触角接近临界值，提示SF是耐水性很好的固载材料，随着BG的加入，材料的亲水性增加，更利于细胞在材料表面的粘附。另一方面，亲水性对材料的降解有决定性作用，同时也影响到其机械性能。FTIR和接触角分析显示，BG58S/SF膜是一种理想的生物膜材料。本实验将hDPSCs接种到材料膜上，SEM和细胞骨架荧光染色结果显示，实验组的hDPSCs均呈长梭形交织层叠生长，细胞触角粘附在材料表面；细胞增殖实验显示，hDPSCs接种于BG58S/SF膜的前4 d无显著增长，第7天后，B、C两组细胞增殖达到对数期，与之前体外实验BG在组织培养液中释放出高浓度的Ca2+，3 d后Ca2+的释放趋于稳定，含适宜浓度无机离子培养液的微环境对细胞更有利[25]的研究结果相符。11、14 d时， C组细胞的增殖能力显著高于B组，提示5 mg/mL BG58S/SF膜促进了细胞的有丝分裂以维持hDPSCs处于生长周期且优于1 mg/mL BG58S/SF膜，其释放动力学机制需要进一步研究。

将hDPSCs分别接种于各组，在第7、14、21天检测DMP-1、DSP、ALP、OC、BSP基因的表达水平。RT-PCR检测结果显示，7 d时，B、C组细胞DMP-1、DSP、ALP、OC、BSP的表达显著上调，提示BG58S/SF膜促进了hDPSCs向成牙本质细胞向分化且具有矿化潜能。组间比较发现，C组细胞的基因表达上调较B组更为显著，推测58S所释放出的离子浓度对hDPSCs的分化产生了重要影响。在成骨细胞中同样观测到了类似的离子浓度依懒性，当Si4+浓度在15～20 μg/mL时可促进成骨细胞新陈代谢达到峰值，并同时促进cbfa1的表达，增强矿化结节的形成; 还发现低(2～4 mmol)、中(6～8 mmol)浓度的Ca2+适于成骨细胞的增殖、分化及细胞外基质矿化[26-27]。组织再生需要大量自体细胞或外源性细胞进入细胞周期经历分化形成靶组织，且需要将细胞毒性刺激降到最低或避免细胞过早进入凋亡期[18]。本结果发现，7 d时，B、C两组细胞增殖显著增快；11 d时，C组细胞增殖水平高于B组，表明5 mg/mL BG58S/SF膜溶解后的离子浓度使hDPSCs无论是数量上或时间上在其增殖与凋亡之间均获得了适当的平衡，而这种平衡有利于Si4+、Ca2+、P5+等调控hDPSCs向成牙本质细胞方向分化和细胞间基质矿化基因的表达。hDPSCs成牙本质细胞样分化相关基因DMP-1、DSP、ALP、OC、BSP表达结果显示，5 mg/mL BG58S/SF膜各相关基因表达水平均高于1 mg/mL BG58S/SF膜，该结果与5 mg/mL 58S/SF膜维持了更多的细胞处于细胞周期相一致。

本结果表明，5 mg/mL BG58S/SF对hDPSCs增殖和分化作用更为理想，是一种具有促进牙本质-牙髓复合体再生潜能的组织工程膜材料，为牙本质-牙髓复合体再生提供了新的思路和方法。

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Bioactive glass 58S/silk fibroin membrane premotes proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells

LYU Xiao-shuai, LI Zheng-mao, YANG Xue-chao

(KeyLaboratoryofOralMedicine,GuangzhouInstituteofOralDisease,StomatologyHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510140,China)

AIM: To investigate the effect of bioactive glass 58S/silk fibroin (BG58S/SF) membrane on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs). METHODS:hDPSCs were seeded on pure SF membrane and BG58S/SF with BG58S at 1 mg/mL and 5 mg/mL respectively after the materials were incubated in cell culture medium for 24 hours. Cell proliferation was assessed by CCK-8 kit after 4, 7, 14 and 21 d culture respectively. The adhesion of hDPSCs on the material surface was evaluated by SEM and cytoskeleton staining; ALP activity was measured by ALP kit and the expression of odontoblastic differentiation-related genes was measured by RT-PCR. One-way ANOVA and paired test were used for statistical analysis . RESULTS： hDPSCs proliferated well on the surface of the membranes throughout the culture period. ALP activity was enhanced in all the 3 groups from day 7, BG58S/SF membrane groups showed higher ALP activity than SF group (P<0.05). BG58S/SF groups showed higher up-regulation of odontoblastic differentiation-associated genes than to SF group (P<0.05). ALP activity and orodontoblastic differentiation-associated gene expression level in 5 mg/mL BG58S/SF group was higher than that in 1 mg/mL group (P<0.05). CONCLUSION: BG58S/SF membrane may promote the proliferation and odontoblastic differentiation of hDPSCs.

bioactive glass; human dental pulp stem cells; silk fibroin; tissue engineering

2015-05-29;

2015-08-18

广东省教育厅特色创新项目(2014TSCX103)

吕孝帅(1988-)，女，汉族，湖北武汉人。硕士生(导师：杨雪超)

杨雪超，E-mail: xyang.gmu@gmail.com

R780.2

A

1005-2593(2015)10-0577-07

广州省科技厅科技计划项目(2013-53)

广东省医学科研基金(A2014328)

广东省2015高等教育“创新强校工程”专项资金(B1531033)