线性探针法与传统药敏法筛查耐多药肺结核符合性的研究

刘 然， 郭春梅， 刘佃香， 李玉梅

(大庆市第二医院检验科，黑龙江大庆1634610)

在防治肺结核的工作中，由于患者不规范治疗的原因，造成耐药肺结核的问题非常严重。中国耐多药结核病疫情居高不下，耐药性结核病的产生在很大的程度上影响了结核病治疗的疗效，尤其耐多药结核病(multidrug resistance tuberculosis，MDRTB)已成为当前结核病防治中的一个难题［1］，也是结核病患者死亡的最大杀手，所以早期能够及时、快速地对结核病耐药性进行检测，让患者得到科学治疗十分重要。目前肺结核耐药性主要靠细菌学检查(包括细菌培养、菌种鉴定与药物敏感试验)，由于结核分枝杆菌生长缓慢，整个培养、菌种鉴定加上药物敏感试验时间最快也要2个月，不能有效指导临床治疗同时也加大了病原菌传播机会。由此可见，寻找快速的检测方法意义重大。我们采用线性探针法用于快速筛查耐多药肺结核，只需要2 d时间［2］，就可以检测出利福平和异烟肼耐药的涂片阳性肺结核患者。

一、材料和方法

1.标本来源 大庆市第二医院2014年5月至2014年12月收治的明确诊断为肺结核住院患者。结核分枝杆菌涂片阳性标本86份;结核分枝杆菌传统罗氏培养阳性30份。

2.主要仪器与试剂 珠海贝索生物技术有限公司生产的改良L-J培养基及含药培养基;HAIN结核分枝杆菌耐药快速检测系统［3］;GenoType MTBDRplus试剂盒购自德国Hain公司。

3.传统药敏试验 用传统改良L-J培养基检测对利福平、异烟肼等抗结核药物的敏感性。使用药物最终浓度分别为利福平40.0μg/mL、异烟肼0.2μg/mL。按照全国临床检验操作规程操作要求用接种环刮取改良L-J培养基表面的菌落，以0.5%Tween 80生理盐水磨菌配成1 mg/mL的菌液，进行100倍稀释。混匀后取菌液0.1mL，均匀地接种于培养基斜面上，每1种药物接种2支培养基，同时接种0.1mL于不含药的培养基，每周观察1次，至4周报告结果。

4.线性探针法检测 (1)对涂片阳性标本的检测:使用碱处理-中和离心沉淀法对痰标本进行前消化处理。0.1mL接种改良L-J培养基，37℃培养。取经前消化处理后的痰标本按照分子线性探针杂交，严格按照GenoType MTBDR说明书要求操作，检测流程包括目的基因片段的扩增、反向杂交膜显色(使用GenoTypeHot40专用程序)、结果判读;(2)对阳性培养物检测:将从罗氏培养基上刮取一接种环结核分枝杆菌混匀于装有200μL双蒸水的1.5 mL离心管中，95℃金属浴灭活30 min。用基因提取试剂盒提取结核分枝杆菌核酸，再进行基因片段的扩增、反向杂交膜显色(使用GenoTypeHot30专用程序)、结果判读。

5.判读标准(参照试剂盒说明书)(1)肉眼观察杂交条带显色情况，只有那些与扩增指控带(AC)强度相同或更强的条带才可判断为阳性;条带上的标记物质控(CC)、AC、结核分枝杆菌复合群及位点质控(rpoB、KatG、inhA)需全部阳性，结果方可进行判读，否则为无效结果;(2)野生型探针:所有野生型探针条带阳性，表示检测区没有发生可检出的突变，试验菌株对各自抗菌药物敏感;如果至少有1个野生型探针信号缺失，则表示试验菌株对相应的抗菌药物耐药;如果rpoB野生型探针信号缺失，则可得出试验菌株对利福平耐药的结论;如果KatG野生型探针缺失，则可得出试验菌株对高水平异烟肼耐药的结论，如果inhA野生型探针缺失，则可得出试验菌株对低水平异烟肼耐药性的结论;(3)突变探针:如果rpoB突变型探针信号阳性，则可得出试验菌株对利福平耐药的结论;如果KatG突变型探针信号阳性，则可得出试验菌株对高水平异烟肼耐药的结论，如果inhA突变型探针信号阳性，则可得出试验菌株对低水平异烟肼耐药性的结论。

二、结果

1.对86份结核分枝杆菌涂片阳性标本进行分析。结果显示利福平单耐药2种方法的符合率为95.6%，见表1。

表1 86份结核分枝杆菌涂片阳性标本分析

2.采用传统药敏试验和线性探针法同时对30份结核分枝杆菌阳性培养物进行分析。结果显示利福平单耐药、异烟肼单耐药及二者同时耐药的符合率均为100%。见表2。

表2 30份结核分枝杆菌阳性培养物分析

3.对86份结核分枝杆菌涂片阳性标本分别采用传统培养和线性探针方法检测分析。发现用传统培养法结核分枝杆菌阳性84份，阳性符合率97.6%，而用线性探针法则结核分枝杆菌阳性86份，阳性符合率达100%。

4.对30份结核分枝杆菌培养阳性物进行线性探针方法检测，结核分枝杆菌复合群均为阳性，符合率为100%(30/30)。

三、讨论

线性探针法的主要原理是在标本中提取核酸DNA、用生物素标记的引物进行多重聚合酶链反应扩增和反向杂交。通过检测RPOB基因突变(编码还原型辅酶Ⅰ聚合酶B-亚单位)确定对利福平的耐药性［4］;通过检测KATG基因(编码过氧化氢酶)和INHA基因的启动子区(编码NADH烯酰酸性磷酸酶还原酶)确定对异烟肼的耐药性［5-6］。

传统药敏试验是检测药物耐药性的金标准，但检测时间太长。通过对线性探针法、传统药敏法检测利福平和异烟肼耐药符合性的研究，耐药结果符合率达到了100%。线性探针法快速筛查耐多药肺结核，只需要2 d时间。本研究结果显示，对结核杆菌涂片阳性标本直接采用线性探针方法筛查耐多药肺结核，既快速又准确，能快速为临床提供耐多药肺结核的耐药检测结果，让患者得到及时科学治疗，临床意义重大。

［1］中华人民共和国卫生部.全国结核病耐药性基线调查报告(2007-2008)［M］.北京:人民卫生出版社，2010:1-3.

［2］单万水，单金岚，詹能勇，等.DNA芯片快速检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变［J］.中华检验医学杂志，2003，26(11):680-682.

［3］中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室.线性探针耐药性检测方法应用评估实施细则［S］.北京:中国疾病预防控制中心，2010:37-47.

［4］MILLER LP，CRAWFORD JT，SHINNICK TM.The rpoB gene of Mycobacterium tuloercubsis［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38(4):805-811.

［5］MANI C，SELVAKUMAR N，NARAYANAN S，etal.Mutations in the rpoB gene of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from India［J］.JClin Microbiol，2001，39(8):2987-2990.

［6］VILCHÈZE C，WEISBROD TR，CHEN B，etal.Altered NADH/NAD+ratio mediates coresistance to isoniazid and ethionamide in mycobacteria［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(2):708-720.