银屑病患者Th17和Treg细胞及其相关细胞因子的表达

杨婷婷， 王 青， 李 志， 朴 君， 朴敬爱

(1.大连市中心医院检验科，辽宁大连116033;2.辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连116033)

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，主要表现为表皮角质细胞过度增生和炎症细胞浸润，其发病机制尚不明确，现常用外用药物或光线疗法控制其病情的发展，但不能根治且易复发，有关专家表示未来的治疗模式应为药物阻断致病过程中导致银屑病斑块形成的过程，这就迫切需要找到其发病的根本机制［1］。关于其发病机制现认为CD4+T淋巴细胞免疫功能异常发挥着重要作用。以前研究证实银屑病发病中存在辅助性T细胞1(T helper cell 1，Th1)和Th2细胞平衡失调，且以Th1型反应为主。此后发现，除了Th1和Th2细胞，T细胞亚群的另两位成员辅助性T细胞 17(T helper cell 17，Th17)和调节性 T(regulatory T，Treg)细胞在各类自身免疫性及炎症性疾病中均发挥重要作用［2-4］。此外，最近研究显示Th17和Treg细胞的分化与机体的生理状态密切相关，此过程可能成为自身免疫性疾病发生的关键环节［5］。本研究从细胞、mRNA和蛋白3种不同水平对银屑病患者外周血Th17/Treg细胞及其相关因子进行动态检测，以期进一步了解Th17/Treg细胞及其相关因子与银屑病之间的相互关系。

材料和方法

一、研究对象

选取2013年3月至2014年1月在大连市中心医院门诊就诊的银屑病患者53例，男33例，女20例，年龄24～71岁，平均年龄39.5岁，病程1个月～7年不等。所有患者符合银屑病的诊断标准:具有典型的红斑、银白色鳞屑等皮疹，均经临床与组织病理检查确诊。其中银屑病患者轻度28例［1＜银屑病皮损面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index，PASI score)≤25］，重度25例(PASI score＞25)。所有患者1个月内未使用皮质类固醇激素和免疫抑制剂。排除其他严重疾病、其他皮肤病及自身免疫性疾病。另选取健康对照组25名，为大连市中心医院健康体检者，无免疫性及系统性疾病，无银屑病家族史和其他皮肤病。健康对照组与患者组一般资料比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

二、仪器与试剂

异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记-抗人CD3单克隆抗体、FITC标记-抗人 CD4单克隆抗体、藻红蛋白花青素 5.1(phycoerythrin green pigment 5.1，PC5)标记-抗人CD4单克隆抗体、PC5标记-抗人CD25单克隆抗体及固定破膜剂为美国Beckman Coulter公司产品，藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记-抗人白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)单克隆抗体及同型、PE标记-抗人叉头状转录因子(forkhead box P3，Foxp3)单克隆抗体及同型为美国eBioscience公司产品，12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、离子霉素和莫能霉素为美国Sigma公司产品，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0为大连宝生物有限公司产品，人 IL-17酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)定量测定试剂盒为北京博凌科为生物科技有限公司产品，人转化生长因子 β(transforming growth factor beta ，TGF-β)ELISA 定量测定试剂盒为R＆D公司产品，流式细胞仪EPICS XL为美国Beckman Coulter公司产品，引物由大连宝生物有限公司合成。

三、样本采集和处理

受检者清晨空腹静脉采血，置于肝素钠抗凝管中用于Treg细胞和Th17细胞的流式检测;置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中用于逆转录聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR);置于非抗凝管中用于IL-17和TGF-β定量测定。

四、方法

1.流式细胞术检测Th17细胞和Treg细胞密度梯度离心法(Ficoll)分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，将分离出的外周血PBMC加入CD3和CD4的荧光标记抗体温育30 min，用于Th17细胞的表面标记，温育后的样本用RPMI-1640培养液洗涤，并加入到特殊培养液中(含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50 ng/mL PMA、离子霉素1μg/mL、莫能霉素3 mmol/L)，置于37℃温箱温育18～20 h(特殊培养液各组分浓度和细胞培养时间等参考试剂厂家提供的数据，并经数次预实验结果确定)。培养后的细胞进行固定破膜(按照说明书操作)，之后加入荧光标记IL-17抗体和对照抗体，温育30 min后待测。取外周全血200μL加入CD4和CD25的荧光标记抗体温育20 min，然后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)洗涤样本后进行固定破膜(按说明书操作)，最后加入荧光标记Foxp3单克隆抗体和对照抗体，温育30 min。流式细胞仪测定标记的2种细胞的荧光强度，界定CD3+CD4+CD17+为Th17细胞，CD4+CD25highFoxp3+为Treg细胞。

2.逆转录PCR检测维甲酸相关孤儿受体γt(retinoid-related orphan receptor gamma t，RORγt)和Foxp3 mRNA的表达 Trizol法提取RNA后，逆转录合成cDNA，按以下条件进行逆转录反应:30℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，5 ℃5 min。然后PCR扩增目标DNA，35个循环结束后，取5μL产物进行琼脂糖电泳(50 mV，20 mA，30 min)，产物用凝胶成像系统扫描，检测基因与内参照条带灰度值的比值表示该基因mRNA的表达水平。以β-actin mRNA表达量为内参照，引物序列由大连宝生物有限公司设计和合成，Foxp3上游引物:5'-CACCCAGGAAAGACAGCAACC-3';下游引物:5'-GCAAGAGCTCTTGTCCATTGA-3'。RORγt上游引物:5'-ACCTCCACTGCCAGCTGTGTGCTGTC-3';下游引物:5'-TCATTTCTGCACTTCTGCATGTAGACTGTCCC-3'。β-actin 上 游 引物:5'-TCA-TGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3';下游引物:5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3'。

3.ELISA检测IL-17和TGF-β浓度 按照相应试剂盒说明书进行细胞因子IL-17和TGF-β的测定。

五、统计学方法

结 果

一、各组外周血Th17细胞和Treg细胞的比例

与健康对照组比较，轻度和重度银屑病患者外周血Th17细胞比例显著升高(P＜0.05)，且轻度组和重度组间差异亦有统计学意义(P＜0.05)。与健康对照组比较，重度银屑病患者外周血Treg细胞比例显著降低(P＜0.05)，轻度组与健康对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1、图2。

二、各组外周血Foxp3、RORγt mRNA的表达

与健康对照组比较，银屑病患者外周血RORγt mRNA的表达显著升高(P＜0.05)，且轻度组和重度组间差异亦有统计学意义(P＜0.05)。与健康对照组和轻度银屑病患者比较，重度银屑病患者Foxp3 mRNA表达显著降低(P＜0.05)，轻度组与健康对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1、图3。

图1 流式细胞术检测Th17细胞和Treg细胞的表达

图2 各组外周血中Th17和Treg细胞所占比例

表1 各组外周血中Foxp3和RORγt mRNA的表达

图3 逆转录PCR检测Foxp3、RORγt mRNA的表达

三、各组外周血IL-17、TGF-β的水平

与健康对照组比较，银屑病患者血浆IL-17的水平均显著升高(P＜0.05)，且轻度组和重度组间差异亦有统计学意义(P＜0.05)。与健康对照组和轻度银屑病患者比较，重度银屑病患者体内TGF-β水平明显降低(P＜0.05)，而轻度组与健康对照组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 各组外周血中IL-17、TGF-β的水平比较

讨 论

T细胞功能异常是维持银屑病疾病活动性的中心环节，与皮损的发生、发展和持续密切相关。本实验联合了流式细胞术、逆转录PCR及酶联免疫定量技术对银屑病疾病组和健康对照组Th17、Treg细胞及其转录因子和细胞因子水平进行了反复检测，从细胞水平、转录因子水平及蛋白水平对银屑病患者外周血中2种细胞的表达进行研究。

本研究结果显示，随着银屑病患者疾病严重程度的加深，外周血Th17细胞所占的比例及其特异性转录因子RORγt的mRNA表达水平及血浆中IL-17的表达水平均明显上调，与国内外现有的大多数研究结果相一致［6］。另有学者发现银屑病皮损真皮浅层IL-17阳性单一核细胞数显著增加［7］。此外，有学者指出炎症性树突状细胞释放IL-23和IL-12激活产生IL-17的T细胞，Th1细胞和Th22细胞产生大量的银屑病细胞因子IL-17、γ 干扰素(interferon gamma，IFN-γ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和 IL-22，这些细胞因子介导产生角质形成细胞放大了银屑病的炎症反应［8］。以上结果充分说明了Th17细胞及相关细胞因子IL-17、IL-23及TNF在银屑病发病过程中的重要性。本实验结果说明随着疾病严重程度的加深，其表达也随之增加，推测其可能参与中性粒细胞增生、成熟和趋化，诱导中性粒细胞迁移到银屑病皮损处，加重炎症反应。EKMAN等［9］通过实验证实银屑病患者在接受紫外线照射治疗后IL-17水平明显下降，趋近于正常对照组的水平，提示靶向阻断Th17/IL-17通路可能阻止疾病的发生和发展。

CD4+CD25highFoxp3+细胞是一种免疫性抑制细胞，在维持机体内环境稳定、诱导移植耐受及自身免疫性疾病的发生、发展中起重要作用。本研究显示，重度银屑病患者外周血CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞的表达显著低于健康对照组(P＜0.05)，而轻度组与健康对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。但是由于Treg细胞在外周血中的数量较少，我们又比较了各组Treg细胞的特异性转录因子Foxp3 mRNA及细胞因子TGF-β的表达，结果显示重度银屑病患者Foxp3 mRNA的表达和TGF-β的浓度显著低于轻度组和健康对照组，与流式检测的结果一致，说明银屑病患者体内可能存在Treg细胞数量的减少以及免疫调节功能的缺失。以上结果可以证实无论是Treg细胞数量还是功能显著降低，不足以抑制效应淋巴细胞的增殖及免疫效应功能，导致炎症性细胞的过度分化。另一方面Treg细胞由于所处细胞环境的变化可能转化为Th17细胞，使其免疫抑制功能减弱而导致效应T细胞过度增殖，促进炎症的发展［5，10］。然而在这一领域相关的研究亦有不同的结论，YAN等［11］研究发现银屑病患者皮损区CD4+CD25highFoxp3+Treg细胞的数量要高于健康对照组，且与疾病的严重程度呈正相关关系。出现以上不同的结果可能与所选取的研究对象所处的病程及取材的部位不同有关。由此可见Treg细胞及相关因子在银屑病患者体内的行为尚存在争议，还需要大量的实验进一步确定Treg细胞在患者体内的表达。

在不同的细胞因子环境中通过不同的信号途径对初始CD4+T细胞向Treg或Th17细胞的分化进行调节。Treg和Th17细胞的分化紧密联系，低剂量TGF-β联合IL-21或IL-1、IL-6可诱导初始T细胞向Th17分化;高剂量TGF-β和在缺少炎症因子的情况下，TGF-β就会转而抑制Th17的分化，促进Treg细胞分化，可以看出Treg和Th17细胞在分化及功能上是相互拮抗的。本研究结果显示，银屑病患者血浆中Th17细胞显著升高且与疾病严重程度相关，而重度患者Treg细胞明显减少，说明Th17细胞的过度分化、Treg细胞的数量减少及功能受损导致的Th17/Treg平衡失调可能是银屑病发病的重要原因。此外，在促炎条件下，Treg细胞能分化成Th17细胞，重度银屑病患者Treg细胞分化功能的增强源于RORγt表达的增多和Foxp3表达的减少，RORγt和Foxp3两者的平衡或许是决定2种细胞分化方向的关键［12］。

综上所述，在银屑病的发生、发展过程中，可以通过Th17和Treg细胞失衡来解释部分发病机制，但是银屑病Th17细胞的招募、增殖及与Treg细胞之间的分化和转化的基本机制有待进一步研究，以期为银屑病发病机制的探讨及临床治疗提供理论基础。

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