响应曲面法优化酸性电解水对鲜切苹果杀菌效果的影响

于晓霞，李燕，王婷婷，宋星

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

响应曲面法优化酸性电解水对鲜切苹果杀菌效果的影响

于晓霞，李燕*，王婷婷，宋星

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

以微生物减菌率为评价指标，在单因素试验的基础上，采用中心组合设计法，研究NaCl质量浓度、处理温度、处理时间，以及料液比对接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和单增细胞李斯特菌的鲜切苹果杀菌效果的影响。响应面分析结果表明，鲜切苹果减菌工艺最优条件为：NaCl质量浓度4.5 g/L，处理温度25℃，处理时间6.45 min，液料比6∶1（mL/g），在此条件下经处理后细菌总数由1.14×105CFU/g降为9.3×103CFU/g，减菌率可达91.84%。同时，该处理对鲜切苹果的pH值和可溶性固形物影响不大，且能较好地抑制维生素C的降解及其表面的褐变。

鲜切苹果；响应曲面法；中心组合设计；工艺优化

鲜切果蔬又名半处理果蔬或轻度加工果蔬，是对新鲜果蔬进行分级、整理、清洗、切分、保鲜、包装等处理，并使产品保持生鲜状态的制品。消费者购买这类产品后，不需要作进一步的处理，可直接食用或烹饪。随着现代生活节奏的加快和生活水平的提高，人们对果蔬消费的需求越来越高，鲜切果蔬以其新鲜、方便、营养丰富和无公害等特点，近年来在欧美和日本等一些国家发展很快，在我国也开始受到关注［1］。然而，由于果蔬组织内的营养汁液大量外流，给微生物的生长与繁殖提供了良好的环境条件，以致鲜切果蔬表面微生物大量滋生而引起腐败［2］。近年来，鲜切水果常与大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌等引起的食源性疾病联系起来［3-5］。有研究表明，在未冷藏或10℃以上的储存环境下，大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌和单增细胞李斯特菌能在水果组织中生长，比如苹果［3，6-7］。因此，如何在加工过程中有效减少微生物污染，最大限度保持产品的安全性与品质，延长货架期，一直是鲜切果蔬加工中的关键性难题［8］。用消毒剂清洗产品是鲜切果蔬生产链中减少腐败菌以及潜在病原菌的唯一途径［9-10］。目前，鲜切果蔬加工过程中常用的消毒剂有臭氧［11］、双氧水［12］和含氯制剂［13］等。双氧水属于低毒杀菌剂，使用量如果不当会对人体产生潜在的致癌性；臭氧虽能有效杀菌，但因为存在着残留物发生氧化反应产生副产物的可能，其使用一直存在质疑；含氯制剂因其对设备的腐蚀性及存在余氯残留的危害，使用也受到一定限制［14］。

酸性电解水（acidic electrolyzed water，AEW）是由电解法产生的一种新型杀菌剂，相较于传统的消毒剂，具有杀菌能力强、杀菌范围广、无污染、无残留、对人体安全、制取方便、价格低廉等特点，近年来得到了越来越广泛的关注［15］。至今，酸性电解水作为消毒剂已广泛应用于研究以及实际生产中［16］。已有不少研究表明，酸性电解水能有效地减少或消除鲜切果蔬中的食源性病菌［17-21］。响应曲面法（response surface methodology，RSM）是统计、设计、试验技术的合成，采用合理的试验设计，能以最经济的方式，以很少的试验数量和时间对实验进行全面研究，它可以有效快速地确定多因子系统的最佳条件，该法已经广泛地应用于各类条件优化实践中［22-23］。

本文主要报道的是酸性电解水对鲜切苹果的杀菌工艺。在单因子试验的基础上，对影响减菌率的各因子NaCl质量浓度、处理时间、处理温度、液料比等进行了初步探究，再借助试验设计软件Design Expert（version 8.0.6），采用响应曲面法的中心组合设计（Central composite design，CCD），对各影响因子间的单一和交互作用等进行了较深入的研究，并优化出最佳的减菌工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠杆菌ATCC 25922、沙门氏菌ATCC14028和单增李斯特菌ATCC 19115，菌株均为上海海洋大学食品学院保存菌株。以该4种常见的食源性致病菌的混合菌悬液模拟鲜切苹果在流通过程中可能存在的细菌残留情况。

1.1.2 培养基、试剂和设备胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），购自北京陆桥技术有限责任公司；NaCl为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

FW-200型强AEW生成器，日本AMANO公司制造；SW-CJ-2F超净工作台，苏州净化设备有限公司制造；pH/ORP测定仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司制造；JT-B匀浆仪，漯河市金田实验设备研究所研制；SX-500型高压灭菌锅，上海田源生物技术有限公司制造；QYC-2102C全温培养摇床，上海沪粤明科学仪器有限公司制造；PYX-DHS恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂制造；还有移液枪等日常用工具。

1.2 方法

1.2.1 微生物总数测定采用GB 4789.2-2010《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》方法进行测定［24］。

式（1）中：Y为减菌率/%；V为空白处理的苹果切片微生物菌落总数/（CFU/g）；V1为酸性电解水浸泡处理的苹果切片微生物菌落总数/（CFU/g）。

1.2.2 酸性电解水的制备采用二槽隔膜电解水装置，通过调解电压、电流、电解时间、电解液浓度等参数制得电解水。本实验通过配置不同质量浓度NaCl溶液电解15 min制得不同浓度酸性电解水。酸性电解水的物理指标包括：pH、氧化还原电位（ORP）和有效氯质量浓度（ACC）。其中pH和ORP由pH/ORP测定仪测得，ACC采用碘量法滴定。本实验所用酸性电解水的指标范围为pH 2.32～2.57，ORP 1125～1188 mV，ACC 58～134 mg/L。

1.2.3 菌液的制备将50 μL甘油保藏的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特菌分别接种到5 mL灭菌TSB上，（36±1）℃和150 r/min摇床培养（24±1）h活化，活化后取4种菌各1 mL于试管中混合，即为混合菌悬液，菌液浓度为8～9 lg CFU/mL。

1.2.4 样品制备及样品表面接种苹果购自上海海洋大学共享区，品种为红富士，使用前于4℃下贮藏。使用时去皮去核，用无菌刀于超净工作台内切取（10±1）g苹果，待其温度恢复至室温后，正反面紫外照射杀菌各15 min。将上述菌悬液用1 mL移液枪滴加到苹果切片表面0.5 mL，15 min后再滴加到另一侧0.5 mL，于超净台放置30 min使细菌吸附在苹果切片表面。苹果切片最终菌落数约为4～5 lg CFU/g。

1.2.5 NaCl质量浓度单因素试验取上述接种过的苹果切片，分别于8倍体积预热至30℃的1、2、3、4、5 g/L和6 g/L NaCl产生的酸性电解水中浸泡5 min后取出，放入含质量分数0.85%无菌生理盐水90 mL的无菌匀浆仪中均质1 min，然后选择合适稀释度用质量分数0.85%无菌生理盐水进行稀释。取1 mL的稀释液于无菌平皿内，并将15～20 mL冷却至46℃的TSA培养基倾注平皿，混合均匀，于（36±1）℃培养（24±1）h后计算菌落数。每个处理均做2个平行样本，每个稀释度重复2次。同时以不经任何处理的苹果切片作为减菌试验的空白对照，计算减菌率。

1.2.6 处理温度单因素试验取上述接种过的苹果切片，分别于8倍体积预热至10、20、30、40、50℃和60℃的1 g/L NaCl产生的酸性电解水中，浸泡5 min后取出，然后分别进行菌落总数测定（方法同2.2.4），同时以不经任何处理的苹果切片作为减菌试验的空白对照，计算减菌率。

1.2.7 处理时间单因素试验取上述接种过的苹果切片，分别于8倍体积预热至30℃的1g/L NaCl产生的酸性电解水中，分别处理3、5、7、9、11、13 min后取出，然后分别进行菌落总数测定，同时以不经任何处理的苹果切片作为减菌试验的空白对照，计算减菌率。

1.2.8 液料比单因素试验取上述接种过的苹果切片，分别于4、8、12、16、20和24倍体积预热至30℃的由1 g/L NaCl产生的酸性电解水中浸泡5 min后取出，然后分别进行菌落总数测定，同时以不经任何处理的苹果切片作为减菌试验的空白对照，计算减菌率。

1.2.9 响应曲面法试验设计在单因素试验的基础上，根据Design Expert软件中的中心组合试验设计原理，对NaCl质量浓度、处理时间、处理温度和液料比4个因素设计响应曲面试验以确定最优的减菌工艺。以减菌率为响应值，自变量为NaCl质量浓度、处理时间、处理温度、液料比，分别以X1、X2、X3和X4来表示，并以+1、0、-1分别代表变量的水平，按方程

对自变量进行编码，式（2）中xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长。因素编码及各自变量水平见表1。

表1 试验因素水平及编码Table 1Variables and experimental design levels for response surface

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 NaCl质量浓度的选择由图1可见，随着NaCl质量浓度增加，苹果切片减菌率逐渐增大，当NaCl质量浓度大到4 g/L后，减菌率增加缓慢且曲线趋于平坦。由于高质量浓度NaCl所产生的酸性电解水具有较高的ACC，从而可能会对苹果切片的品质造成一定的影响。综合考虑成本、减菌效果和产品品质，选择NaCl溶液质量浓度为4 g/L。

图1 NaCl溶液质量浓度对减菌率的影响Fig.1Effects of bacteria reduction of NaCl mass concentration

2.1.2 处理温度的选择由图2可见，随着处理温度的增加，苹果切片减菌率迅速增加，当温度大于20℃后，减菌率稍微下降，但当温度大于40℃后减菌率又有所上升，这可能是温度过高导致细菌部分失活，从而导致减菌率增加。考虑到高温会影响到苹果本身的感官品质，因而选择处理温度20℃比较合适。

图2 处理温度对减菌率的影响Fig.2Effects of bacteria reduction of treatment temperature

2.1.3 处理时间的选择由图3可知，在处理时间7 min内，苹果切片减菌率增加明显，但随着处理时间继续延长，苹果切片减菌率增加趋于平缓。因此，选择浸泡时间7 min比较合适。

图3 处理时间对减菌率的影响Fig.3Effects of bacteria reduction of treatment time

2.1.4 液料比的选择由图4可以看出，液料比的增加对苹果减菌率有明显的效果，在液料比为8∶1（mL/g）时减菌率基本上达到最大值，之后随着液料比的继续增加，减菌率又略有下降，但不明显，这可能是苹果切片与酸性电解水的接触面积有限，从而一定程度上限制了减菌的效果。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 试验结果综合考虑各种因素对减菌率的影响，采用中心组合设计（CCD）对减菌工艺进行四因素优化试验设计，试验结果见表2。

图4 液料比对减菌率的影响Fig.4Effects of bacteria reduction of solid-liquid ratio

表2 CCD试验设计及响应值的实测和预测值Table 2CCD design matrix along with the experimental and predicted values of Y

2.2.2 模型的建立及其显著性检验利用Design Expert软件，通过表2中试验数据进行多元回归拟合，获得减菌率对编码自变量NaCl质量浓度、处理温度、处理时间、液料比的二次多元回归方程：

从该模型的方差分析（表3）可见，本试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性（Pmodel＜0.01），而失拟项不显著（P=0.219 8＞0.05）。且模型的复相关系数R2为96.59%，大于90%，说明回归方程的拟合程度很好，试验误差小，不存在模型拟合不足的情况，因此该响应面能够较真实地反映试验结果。

表3 二次回归模型的方差分析结果Table3Varianceanalysisforthefittedquadraticpolynomial

2.2.3 苹果切片减菌率的响应面分析与优化根据回归模型作出相应的响应面和等高线，见图5—7。当处理时间为7 min，液料比为8∶1（mL/g）时，NaCl溶液质量浓度和处理温度对减菌率的影响见图5。可以看出，随着NaCl溶液质量浓度、处理温度的增大，减菌率也不断增加。当温度为20℃，液料比为8∶1（mL/g）时，NaCl溶液质量浓度和处理时间对减菌率的影响见图6。可知，随着NaCl溶液质量浓度的增加，减菌率不断增加。在处理时间5～7 min的范围内，减菌率不断增加，之后随着处理时间的延长，减菌率有下降的趋势。

当NaCl溶液质量浓度为4 g/L，处理时间为7 min时，处理温度和液料比对减菌率的影响见图7。从图7可以看出，处理温度15～25℃的范围内减菌率变化不太明显。而液料比6∶1～10∶1（mL/g）的范围内，减菌率则是逐渐较少。

通过软件分析，得到苹果切片杀菌的最佳条件为NaCl溶液质量浓度4.5 g/L，处理温度25℃，处理时间6.45 min，液料比6∶1（mL/g），在此条件下减菌率的理论值为93.54%。在此优化条件下进行3次平行实验，得到的实际平均减菌率为91.84%，其相对误差不到1%，因此基于响应曲面法所得的优化减菌工艺参数准确可靠，得到的鲜切苹果减菌条件具有实际应用价值。

2.3 酸性电解水处理对鲜切苹果品质的影响

将4.5 g/L NaCl电解得到的AEW与自来水对样品的处理结果作比较，同时以未处理组为空白，于25℃下，以6∶1（mL/g）的液料比浸泡鲜切苹果6.45 min，测定各处理后鲜切苹果的pH值、可溶性固形物含量和维生素C含量，其结果见表4。

图5 NaCl溶液质量浓度和处理温度对减菌率影响的响应面图和等高线图Fig.5Response surface plot and contour plot describing the interactive effect of NaCl mass concentration and treatment temperature on bacteria deduction

图6 NaCl溶液质量浓度和处理时间对减菌率影响的响应面图和等高线图Fig.6Respons e surface plot and contour plot describing the interactive effect of NaCl mass concentration and treatment time on bacteria deduction

图7 处理温度和液料比对减菌率影响的响应面图和等高线图Fig.7Respons e surface plot and contour plot describing the interactive effect of treatment temperature and solid-liquid ratio on bacteria deduction

表4 不同清洗方式对苹果品质的影响Table 4Effects of different washing methods on the quality of fresh-cut apples

由表4可知，AEW处理后，鲜切苹果的pH值与空白组相差不大，虽然可溶性固形物含量较空白组有所下降，但与自来水处理组相近，同时AEW处理能更好地抑制维生素C的降解。比较3 h内鲜切苹果的褐变情况，样品处理后空白组已显示轻微褐变，自来水组与AEW组均无褐变；3 h时，空白组已严重褐变，自来水组轻微褐变，而AEW组仍具有良好的色泽，故而推测AEW处理可以有效地抑制鲜切苹果的褐变。

3 结语

在单因素试验的基础上，运用响应面分析法对苹果切片减菌工艺进行优化。得到最优工艺条件为：NaCl溶液质量浓度4.5 g/L，处理温度25℃，处理时间6.45 min，液料比6∶1（mL/g），在此条件下经处理后细菌总数由1.14×105CFU/g降为9.3×103CFU/g，减菌率可达91.84%。同时，该处理对鲜切苹果的pH值和可溶性固形物影响不大，且能较好地抑制维生素C的降解及其表面的褐变。

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Response Surface Methodology for Optimization of Sterilization Effect on Fresh-Cut Apple Treated with Acidic Electrolyzed Water

YU Xiaoxia，LI Yan，WANG Tingting，SONG Xing
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The sterilization effect of acidic electrolyzed water on fresh-cut apple against Staphylococcus aureus，Escherichia coli，salmonella and Listeria monocytogenes cells was studied by response surface methodology and a central composite design with one-factor-at-a-time.Studied variables of NaCl concentration，time，temperature and solid-liquid ratio were selected for the determination of optimal conditions with bactericidal ability evaluated.The optimal conditions were found to be as follows：6：1 liquid-solid ratio（mL/g）and 4.5 g/L NaCl treated under 25℃for 6.45 min.Under these conditions，the total bacteria count was reduced from 1.14×105CFU/g to 9.3×103CFU/g and the reduction rate of bacteria was up to 91.84%.Moreover，this treatment slightly affected the pH value and the soluble solid contents of fresh-cut apples，while effectively inhibited the degradation of vitamin c and provided surface browning control.

fresh-cut apple，response surface methodology，central composite design，optimization

TS201.6

A

1673—1689（2015）06—0653—07

2014-05-28

上海市科委工程中心建设项目（11DZ2280300）

*通讯作者：李燕（1965-），女，天津人，工学硕士，教授，主要从事生物活性物质的提取及应用，以及食品应用化学的研究。E-mail：liyan@shou.edu.cn