燕窝唾液酸检测方法研究综述

操 然

（福建农林大学 材料工程学院，福建 福州350002）

燕窝是金丝燕属（Collocalia）雨燕科（Apodidae）6 种燕子以其富含蛋白质的唾液和羽绒混合凝结于悬崖峭壁上，或农家屋舍而长成的巢窝。燕窝的种类可以随燕子和筑巢用材分为官燕、毛燕和草燕3种。其中官燕习惯以纯唾液筑成燕巢, 所以杂质较少,其色泽微黄,呈丝瓜络样,加水后变软,吸水力强,是燕窝中的上品；毛燕产自“洞燕”,此类燕子习惯用羽毛混和唾液筑巢,毛燕的吸水力较官燕弱,且颜色较暗,含有杂质营养价值较官燕低；草燕喜以杂草混和口水筑巢,含大量杂质,其燕窝成分是最少的。

燕窝的主要成分为活性糖蛋白和天然营养物质、矿物质，其特征成分为唾液酸糖蛋白，唾液酸糖蛋白由唾液酸、氨基酸和糖构成，在一定的酸性条件下可水解出游离的唾液酸单体，学名N-乙酰神经氨酸。鉴别燕窝的本质就是检测燕窝中的唾液酸是否具符合标准。

图1 唾液酸的化学结构式

1 释放唾液酸

在合理的条件下将唾液酸从低聚糖和糖蛋白中释放出来是检测燕窝唾液酸含量的前提，常见释放唾液酸的方法有酸解法和酶解法。其中酸解法大多用磷酸为利用酸水解断开连接、去乙酰基、去碳酸基，唾液酸释放较为彻底，而且适应性好，无特异性，合适的水解条件是决定唾液酸是否释放完全的关键。检测中所用到的酸有磷酸、冰乙酸、硫酸氢钠、盐酸、三氟乙酸（沸点低，提取后易挥发）、乙酸。所用最多的是硫酸氢钠和磷酸，酶解法利用较少。

2 唾液酸检测方法的研究进展

长期以来，经过科技人员的不懈努力，燕窝唾液酸检测方法不断取得进展，先后发现了气相色谱法、傅里叶红外光谱法、液相色谱法、紫外分光度计法、双抗夹心酶联免疫检测检测方法、离子色谱法等6 大类9 种方法。

2.1 气相色谱法

气相色谱法是将唾液酸通过醇解和三甲基硅烷衍生化后利用气象色谱仪进行分析。在实践中，该方法由早期的毛细管气象色谱法演进到多糖气相色谱法。

2.1.1 毛细管气象色谱法

陈文锐[1]早在1995年就毛细管法测唾液酸进行了研究。毛细管法是将燕窝中唾液酸水解后，通过比对氨基酸含量，判别燕窝的含量。该研究中对真燕窝唾液酸水解后和猪皮鱼鳔等掺假燕窝水解后，对唾液酸中氨基酸种类成分进行了比较，得出的结果为真燕窝中16 种氨基酸的总含量为40.50-45.12%； 而猪皮掺假燕窝为73.46%； 鱼鳔为91.80%；银耳为4.88%；琼脂为1.37%。并根据这些差别鉴定了市面宣称含燕窝的饮品，例如“冰糖燕窝”等，通过实验方法和理论分析其是否含羟基脯氨酸和是否含动物性蛋白，检测出燕窝相关产品的真伪。该方法能粗略检测出燕窝中唾液酸，但不能定量测出唾液酸含量，仅能根据水解后氨基酸种类和含量判断燕窝加工产品中是否含有燕窝，适用于燕窝相关产品检测。

2.1.2 多糖气相色谱法

2011年李波[2]等进行了气相色谱法同时测定多糖中的中性糖、糖醛酸、氨基糖和唾液酸的研究。用1mol/l 盐酸甲醇在85℃反应18-24h，碳酸银中和，加入乙酸酐室温暗处反应24h，使氨基糖重新引N-乙酰基，除银盐，干燥，加入硅烷化试剂，室温放置5天，最后用气相色谱进行分析，实验所用的多糖样品为豆腐渣碱溶性多糖和鸡腿菇多糖。气相色谱法测唾液酸可应用至燕窝中唾液酸的检测中，与液相色谱等方法相比，该方法样品用量少，灵敏度高，分辨率强，分析速度快，但也存在前处理时间长的缺点。

2.2 傅里叶红外光谱法

孙素琴[3]等人在2001 首次利用微钻石ATR 探头傅里叶变换红外光谱法(FTIR)无损快速鉴别了6种燕窝。研究根据燕窝中的唾液酸(N-乙酰神经氨酸)在红外光谱下有特殊的吸收峰，利用微钻石ATR探头FTIR 光谱法直接测定燕窝样品，通过比较不同天然燕窝的红外特征谱可以达到鉴别燕窝的作用。研究中对比了6 种来源不同的燕窝的红外吸收光谱，进行了非均匀性分析，并对比了常见燕窝掺假品猪皮屑、银耳的光谱图，发现猪皮屑和银耳的红外光谱有较大的特征性, 天然燕窝在2925cm-1附近的吸收峰强度较弱，而银耳和猪皮屑则在此处吸收较强；猪皮屑的蛋白质、氨基酸类化合物含量较丰富,即酰胺Ⅰ、Ⅱ带(1629、1531cm-1)的吸收峰较强，1039cm-1附近的吸收峰较弱; 银耳和猪皮屑在1734cm-1附近会出现脂肪类化合物的特征吸收峰，银耳在1021cm-1的吸收峰很强，这是区别燕窝中是否掺有猪皮屑和银耳的判别依据。

傅里叶红外光谱法与传统鉴别方法相比更直观、可靠，可做到无损快速鉴别，缺点是不能定量检测燕中唾液酸，即N-乙酰神经氨酸的含量。

2.3 液相色谱法

液相色谱法是检测唾液酸最常见的方法，主要是将唾液酸在弱酸性条件下水解，从寡糖链、糖脂、糖蛋白中游离出来，利用高效液相色谱法（HPLC）分离，以其他改进或衍生的方法来鉴定。

2.3.1 高效液相色谱法(HPLC)

该方法利用唾液酸在酸性条件下可与某些物质（如邻苯二胺）反应,生成有强紫外吸收的唾液酸衍生物。具体方法是确定高效液相色谱、制备标准曲线、确定检测波长、实际样品测定、HPLC 分析（通过测定处理后的燕窝样品吸收峰的峰面积，用标准曲线法可以计算出其中含唾液酸的含量）。该方法的图谱具有较强的特征性、直观性和一致性,能够鉴别燕窝类保健品的真伪, 还能对燕窝类保健品中的唾液酸含量进行定量测定，具有灵敏度高、重复性好的特点,可准确测定燕窝及其类保健品中唾液酸的含量。

2.3.2 柱前衍生二极管阵列/荧光检测器串联的反相高效液相色谱检测法 (DAD/FLD 串联HPLC 法)

冯婷玉[4]等人在2009年对HPLC 进行改进，该方法采用DAD/FLD 串联HPLC 法，以邻苯二氨盐酸盐(OPD-HCl)为衍生化试剂对唾液酸(N—乙酰神经氨酸)进行定量测定。通过对比不同属解条件，该方法选择了0.5mol/l 硫氢酸钠在80℃水浴加热30 分钟的水解方法，唾液酸在酸性条件下与邻苯二胺反应生成强紫外吸收和荧光的唾液酸衍生物，采用C18 柱分离，四氢呋喃溶液-乙腈为流动相进行等度洗脱，检出限为0.2μg/mL(DAD)，0.005μg/mL(FLD)。

DAD/FLD 串联HPLC 法将最普及的HPLC 检测器DAD 和具有更高的灵敏度和选择性的FLD 串联，弥补各自的不足，保证待测唾液酸在各浓度下能被正确检出。该法具有灵敏度高、检出限低、定量准确、方便快速等特点。

2.3.3 高效液相色谱—质谱法(HPLC-MS)

侯向昶[5]等人在2013年建立了燕窝中唾液酸含量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法。该方法将经磷酸水解后的燕窝中的唾液酸从与唾液酸糖蛋白的结合状态中游离出来，吸取上清液过Oasis HLB 柱，用水淋洗固相萃取柱并弃去全部流出液，用真空泵在40-60kPa 负压下抽干Oasis HLB 固相萃取柱，再用甲醇洗脱被测物，洗脱液40℃水浴中氮气吹干，用流动相溶液定容，采用负离子模式和多反应监测模式超高效液相色谱-串联质谱法检测，并用外标法计算其唾液酸含量。方法的线性范围在0.1-50mg/L 之间，相关系数0.999，检出限为0.02mg/kg，定量限为0.1mg/kg，样品平均加标回收率为93.5%，相对标准偏差1.52%。与其他高效液相色谱法不同的是，该方法省略了唾液酸衍生化的过程，简化了实验流程，同时在流动相中采用高比例水相并采用T3 色谱柱，解决了极性化合物唾液酸在C18 柱上不保留或者需要通过衍生化的方式进行测定的问题。

高效液相色谱—质谱法前处理简单、重复性好、灵敏度高，可应用于燕窝中唾液酸含量的测定。

2.4 紫外分光光度计法（UV-Vis）

李敏[6]等人在2011年研究了用分光光度计方法检测燕窝含量。实验研究了水解时酸的种类、酸的浓度和时间对水解的影响。并得出了最适宜的水解条件为50%的醋酸水解10min。该方法利用唾液酸与酸性茚三酮形成稳定的黄色物质，在470nm 有最大吸收峰的特点，用分光光度计测其吸光度，并根据标准曲线计算出唾液酸含量。该方法准确率高，可定量检测唾液酸含量、定量鉴别燕窝真伪。该方法比HPLC 法结果偏低，但无显著性差异。

2.5 双抗夹心酶联免疫检测方法（ELISA）

张世伟[7]等人在2013年建立一种燕窝中唾液酸糖蛋白双抗夹心酶联免疫检测方法。该方法以唾液酸糖蛋白为抗原, 分别制备唾液酸糖蛋白的多克隆和单克隆抗体。将单克隆抗体为包被抗体, 辣根过氧化物酶标记多克隆抗体为二抗构建燕窝唾液酸糖蛋白的双抗夹心ELISA 方法。本方法的IC50为2.3ng/mL，样品的添加回收率为92%-96%，相对标准偏差小于10%。传统检验方法仅将唾液酸作为检测目标，但目前唾液酸已能进行产业化规模生产，作为食品添加剂、营养强化剂使用，并不是燕窝特有的组分。将唾液酸法作为燕窝制品真伪鉴定的方法，其特异性及可靠程度不高。但该方法利用燕窝中唾液酸主要以唾液酸糖蛋白形式高丰度、特异性存在的，唾液酸蛋白在不同燕窝中含量稳定且不易热变性、热分解，可作为燕窝的指示蛋白。掺伪燕窝由于混入了其他物质，其唾液酸糖蛋白含量将明显偏低。该方法检测实际样品稳定可靠，能检测燕窝中的唾液酸为燕窝所特有而不是另外添加的。

双抗夹心酶联免疫检测方法不易受基质干扰，具有较好的实际应用价值和开发成商品化试剂盒的潜力。该方法具有高灵敏度和高特异性、操作简单、检测成本低等优点。能同时对几十个样品进行检测，可用于生产实际中[8]。

2.6 离子色谱法—积分脉冲安培法

李耿[9]等在2014 采用离子色谱仪、抑制器、电导检测器在一定条件下分别测定燕窝、速食燕窝及伪品中N-乙酰神经氨酸的含量。实验结果N-乙酰神经氨酸在0.25-5.00μg/mL 范围内线性良好，r=0.9999； 在燕窝中的平均回收率为99.7%，RSD=0.82%（n=6）。该方法的优点灵敏度高，可达pmol 水平；分析时间短，一般在15-30min 内即可完成；无需进行衍生化和严格的样品处理；可以使用梯度洗脱；色谱柱的选择性及分辨率高；可定性定量检测燕窝及其相关产品中唾液酸含量。

3 总 结

至今为止，科技工作者发现了6 大类9 种燕窝唾液酸检测方法，各有特点，现综合比较如表1 所示。

表1

续表

对比以上6 大类燕窝鉴别方法，气相色谱法、红外光谱法等方法可粗略检测燕窝中的唾液酸，但不能定量检测出唾液酸的含量，可用于判断加工产品中是否含有燕窝。液相色谱法和紫外分光光度计法和离子色谱—积分脉冲安培法均可以定性定量检测燕窝中唾液酸含量，与传统的高效液相色谱法相比，这两种方法具有分析时间短和流程简单等特点，适合于快速检验。双抗夹心酶联免疫检测检测方法（ELISA）利用燕窝中唾液酸以特异性的唾液酸糖蛋白形式存在的特点设计出的检验方法，该方法不仅具有高灵敏度和高特异性、操作简单、检测成本低等优点，还不易受基质干扰，具有较好的实际应用价值，可开发成商品化试剂盒，可在商业上推广。

[1]陈文锐.毛细管气相色谱法测定燕窝中的氨基酸及掺伪鉴别方法的研究[J].旅行医学科学，1995（03）:110-113，142.

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[3]孙素琴,梁曦云,杨显荣.6 种燕窝的傅里叶变换红外光谱法原性状快速鉴别[J].分析化学,2001（05）:552-554.

[4]冯婷玉,薛长湖,孙通，等.燕窝中唾液酸的DAD/FLD 串联HPLC 测定方法研究[J].食品科学,2010（08）:233-236.

[5]侯向昶,朱丽萍,刘春生，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定燕窝中唾液酸的含量[J].现代食品科技,2013（07）:1706-1709，1720.

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[7]张世伟,赖心田,陈血剑，等.双抗夹心酶联免疫分析法检测燕窝中唾液酸糖蛋白[J].食品工业,2013（06）:195-198.

[8]赖心田,张世伟,陈血建,等.酶联免疫法定量检测市售燕窝及其加工制品中特征蛋白含量[J].农产品加工，2013（18）:4-7，12.

[9]李耿,ASANTE Joseph Obiri，戴洁，等.离子色谱-积分脉冲安培法测定燕窝中N-乙酰神经氨酸的含量[J].广东药学院学报,2014(01）:40-43.