迷迭香精油吸嗅对C57BL/6鼠学习记忆及海马CA1区乙酰胆碱酯酶表达的影响

刘传颂 操礼琼 李光武 傅 佳 (安徽医科大学第一附属医院，安徽 合肥 300)

迷迭香精油是从迷迭香属植物的花絮和叶子蒸馏提取而来的，主要成分有 α-蒎烯、莰烯、1，8-桉树脑、樟脑、龙脑和 β-蒎烯等〔1〕。迷迭香精油作为天然抗菌剂与抗氧化等作用早已广为人知，而在提高认知、延缓衰老等方面缺乏研究。乙酰胆碱酯酶(AchE)是乙酰胆碱的水解酶，反映脑胆碱能系统功能的重要标志酶，通过水解乙酰胆碱调控胆碱能突触的信息传递而调控脑功能。胆碱能系统与记忆的形成和存储密切相关，而学习和记忆能力的下降与乙酰胆碱能神经元活性的下降有直接关系。Jeltsch-David等〔2〕研究表明胆碱能障碍能损害各项认知任务，提高胆碱能功能观察到改善认知能力。本研究观察迷迭香精油对C57BL/6鼠学习记忆及海马CA1区AchE表达的影响，探讨其改善学习记忆能力的作用途径及可能机制。

1 材料与方法

1.1主要器材与试剂 迷迭香精油(新疆盛澜香料有限责任公司，纯度100%)，Lashley-Ⅲ水迷宫(中国医学科学院药物研究所制，型号:SMG-2)，ZnSO4，市售标准品，用0.1 mol/L PBS配制成0.17 mol/L的ZnSO4，兔抗AchE抗体(武汉博士德生物工程有限公司;BA0600)，免疫组化染色试剂盒(博士德生物工程有限公司，批号:SA1022)。

1.2动物 C57BL/6雄性鼠60只，体重20～25 g，3月龄(由安徽医科大学动物实验中心提供)，1 w时间适应于温度23～25℃，湿度在40% ～45%，自然昼夜交替，混合饲料喂养，自由取食和水。

1.3嗅上皮毁损模型制作 将嗅上皮毁损组C57BL/6鼠行3%水合氯醛麻醉后，用微量注射器向双侧鼻孔分别滴入0.17 mol/L的ZnSO4和0.7%Triton X-100(PBS配制)混合液总剂量 50 μl〔3〕，每天 1 次，共 7 d;假手术组:将假手术组 C57BL/6鼠行3%水合氯醛麻醉后，用微量注射器向双侧鼻孔滴入生理盐水 50 μl，每天 1 次，共 7 d。

1.4分组和吸入精油方法 C57BL/6鼠适应性喂养后，通过程控自主活动箱(型号ZIL-2，中国医学科学院药物研究所制)进行自主活动，训练5 d，每天1次，记录180 s C57BL/6鼠自主活动次数，按第5天结果90%区间去除两端极值。再通过Lashley-Ⅲ水迷宫训练5 d，每天进行2次测试(上、下午各1次)，试验第5天，剔除3 min内不能到达平台的小鼠，将剩余的C57BL/6鼠随机分为对照组、假手术组、模型组(嗅上皮毁损组)、嗅上皮完整+迷迭香精油组和模型+迷迭香精油组;每组12只。吸嗅方法参照文献〔4〕，嗅上皮完整+迷迭香精油组和模型+迷迭香精油组吸嗅迷迭香精油;对照组、假手术组、模型组仅吸嗅空气。

1.5LashleⅢ水迷宫实验 实验装置主体为80 cm×50 cm×20 cm双层不透明有机玻璃箱，其内设起始点、终点平台和四个盲端，平台附近为安全区，并放台灯标示，C57BL/6种系小鼠通过了水迷宫台阶才可不被水淹所赵成的伤害。试验过程中环境、水温(20～22℃)不变。将C57BL/6种系小鼠面向水迷宫起始处壁侧放入水中，记录C57BL/6种系小鼠从放入水中到达平台的时间(潜伏期，单位s)，将对前4 d记录的时间，计算出平均值作为实验前C57BL/6种系小鼠水迷宫实验的结果。分别在实验的第1天、第7天和第14天如前文所述的方法进行测试，记录测试结果。

1.6免疫组化方法检测海马CA1区AchE的表达和图像分析 第15天吸嗅后用3%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉下迅速开颅取脑，置入4%多聚甲醛持续固定液24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。按SABC法进行免疫组化染色，DAB显色，苏木素复染，分化反蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片切片置于显微镜下，对所测阳性区域进行定位后，由彩色摄像机提取图像，输入“Image-Pro-Plus 6.0”彩色图像分析系统参考The Rat Brain图谱对C57BL/6种系小鼠海马CA1区进行图像分析。

1.7统计学方法 应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1水迷宫实验结果 5组C57BL/6鼠在实验前、第1、7天和第14天的结果均符合正态性分布，吸嗅前对照组、假手术组、模型组、嗅上皮完整+迷迭香精油组和模型+迷迭香精油组潜伏期分别是:(54.67 ±8.74)s，(56.58 ± 7.14)s，(53.12 ±8.67)s，(54.58± 7.99)s，(52.75± 8.19)s(P ＞0.05);在吸嗅第7、14天嗅上皮完整+迷迭香精油组潜伏期分别为(38.00±5.74)s，(33.75 ±2.03)s，明显缩短，与对照组(60.08 ± 7.67)s，(58.25±7.47)s比较差异显著(P＜0.05);模型组、假手术组和模型+迷迭香精油组第7、14天的潜伏期分别为(56.00±8.75)s，(50.67 ± 8.16)s;(55.50 ± 12.24)s，(55.20 ± 4.16)s;(48.42 ± 5.90)s，(54.00 ± 8.78)s，变化不明显，与对照组(60.08± 7.67)s，(58.25± 7.47)s比较无差异(P＞0.05)。

2.2AChE表达 在海马CA1区，AchE阳性细胞呈黄褐色，集中存在细胞质内和轴突及树突近端，而细胞核显色不明显。对照组阳性细胞数和平均吸光度值与模型组、假手术组、模型+迷迭香精油组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组比较，嗅上皮完整+迷迭香精油组阳性细胞数量和平均吸光度值差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1～图3。

图1 各组海马CA1区AchE免疫组化结果(免疫组化SABC法，×400)

图2 各组AchE阳性细胞数分析

图3 各组海马CA1 AchE平均吸光度值分析

3讨论

迷迭香精油具有提高学习记忆和延缓衰老等作用，能够治疗AD、亚临床型痴呆、重症肌无力。2009年Daiki等〔5〕对28名老年痴呆患者每天早晨吸嗅迷迭香精油28 d，结果显示触摸型痴呆评分TDAS量表和GBSS-J量表评分显著提高，并能够改善患者的抽象思维能力和运动能力，而最明显的是改善认知功能。Yosuke等〔6〕通过给ALS模型鼠腹腔注射迷迭香酸研究发现，迷迭香酸能延缓ALS鼠运动障碍的进展，减少运动神经元变性，延长生存时间。Hong等〔7〕给大鼠服用不同剂量精油发现，服用精油的大鼠去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺增加而胆碱酯酶活性下降。在迷迭香精油影响嗅觉下的实验中能增强对象完成任务的能力，能增强整体记忆能力以及对影响记忆速度情况下也能对其改善。Degel等〔8〕研究显示迷迭香为常见的芳香开窍类物质，刺激嗅觉可提高正常受试者的学习记忆能力。魏凤香等〔9〕用不同浓度的迷迭香精油处理细胞12、24、48 h后表明迷迭香精油诱导肝癌HepG2细胞凋亡与凋亡调控基因bax表达增强和bcl-2表达减少有关。本实验研究显示迷迭香精油吸嗅能改善小鼠学习记忆能力。

嗅上皮主要由嗅感觉神经元(OSNs)、支持细胞和基底细胞组成。气味或嗅质分子特异性地与嗅上皮上相应的受体结合，使嗅神经元细胞产生动作电位，通过其轴突传递至嗅球内的嗅小球。嗅觉信号经过嗅球的加工、修饰、编码后，被传递到嗅前核、梨状前皮质、下丘脑、杏仁核、边缘系统、海马等嗅觉中枢，在此嗅觉信号被解码以分辨不同的气味，形成对气味的感知〔10〕。海马获得内嗅皮质的传入信息并连接顶叶和颞枕区，然后传到齿状回→CA3→CA1→下脚→槽→伞→穹窿→乳头体丘脑束→前丘脑→扣带后部→扣带皮质〔11〕。本实验表明迷迭香精油通过嗅觉通路改善小鼠学习记忆能力。

乙酰胆碱转移酶(ChAT)是乙酰胆碱合成酶，AchE和ChAT通过水解和合成Ach来调控突触间隙的乙酰胆碱含量而影响胆碱能信息传递而影响脑功能，包括对认知功能中的学习记忆的影响。Wilson等〔12〕研究显示，在老年痴呆患者脑组织中AchE的活性显著增强。由于海马和皮层互联，Everitt等〔13〕研究表明这两区域有丰富的胆碱能突触联系;Csernansky等〔14〕研究显示给予胆碱能药如毒扁豆碱和加兰他敏通过显著增加海马和皮层乙酰胆碱恢复空间学习记忆。本研究示迷迭香精油可通过嗅觉通路对AchE有抑制作用。Dimitrova等〔15〕研究显示，胆碱酯酶抑制剂对胆碱能突触有二重作用，抑制AchE和增加Ach水平;Shukitt-Hale等研究证明提高AchE活性增加乙酰胆碱分解干扰胆碱能神经传递和神经元损害。然而，Derrick等〔16〕研究表明增加AchEIs抑制AchE活性能减少神经元损害，提高大鼠学习能力。2002年Zhang等〔17〕对凋亡细胞研究中发现AchE表达增加，给予AchEIs治疗后防止学习记忆损害，可能是在学习脑区抑制AchE活性减少神经元损害。所以，AChEIs不仅能抑制AchE活性，而且能防止神经元损害。本研究表明嗅上皮完整药物组AchE表达减少，突触间隙乙酰胆碱含量增加，学习记忆能力增强可能为其机制之一，是否能防止神经元损伤需进一步研究。

本实验证实了迷迭香精油有改善小鼠学习记忆的作用，其改善学习记忆作用与通过嗅觉途径抑制海马CA1区AchE相关，迷迭香精油吸嗅可以提高学习记忆能力。

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